分子细胞生物学

分子细胞生物学第1页/共65页细胞基本特征1、细胞是高度复杂和组织化的

表现在：有序度和一致性

不同层次和水平：原子（碳、氢、氧、氮、磷、钙（98%）等60多种元素）---小分子（水、无机盐等）---大的聚合物分子（水（结合状态）、蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质）---复合体（染色质：DNA和蛋白质复合）---亚细胞器---细胞每一水平都有很高一致性---电镜下一致的细胞器特定形态和位置---每种细胞器都有一致的大分子成分＊组成生物体的基本元素是C元素＊占细胞总重量的60%-90%，是活细胞中含量是最多的物质。组成生物体的化学元素，在无机自然界都可以找到，没有一种元素是生物界特有的。组成生物体的化学元素在生物体和自然界中含量相差很大。

2第2页/共65页组成细胞膜：脂类、蛋白质、糖类细胞质：如线粒体、溶酶体细胞核：生长、分化、代谢和繁殖的控制中心，染色质核仁：蛋白质、DNA、RNA3第3页/共65页功

能4第4页/共65页生物进化上的保守性：---研究一种生物所得到的信息可直接应用到其他生命形式---我们细胞中的分子必定与30亿年前的原始细胞祖先相似＊大分子：生物大分子进化：指功能上重要的大分子或大分子中功能重要的局部，在进化速率上明显低于那些功能上不重要的大分子或大分子的局部。＊系统：果蝇和包括人类在内的脊椎动物的神经系统起源于进化过程早期的共同祖先（2006）。5第5页/共65页2、细胞具有遗传程序和利用遗传程序的方式有机体按照一套基因编码的信息而构建基因：信息储存库；编制构建细胞结构的蓝图；细胞活动的指南和自身繁衍的程序

6第6页/共65页基因控制生物的性状主要通过两条途径：一是通过控制酶的合成来控制生物的性状。这是因为由基因控制的生物性状要表现出来，必需经过一系列的代谢过程，而代谢过程的每一步都离不开酶的催化，所以基因是通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物个体性状的表现的。另一条途径是基因通过控制结构蛋白的成分直接控制生物的形状。蛋白质多肽链上氨基酸序列都受基因的控制，如果控制蛋白质的基因中ＤＮＡ的碱基发生变化，则可引起信使ＲＮＡ上相应的碱基的变化，从而导致蛋白质的结构变异。此外，遗传性状的表现，不但要受到内部基因的控制，还受到外部条件的制约。因此，不同基因型的个体在不同的环境条件下可以产生不同的表现型，即使同一基因型的个体，在不同环境条件下，也可以产生不同的表现型。也就是说，表现型是基因型与环境共同作用的结果（表观遗传学）。7第7页/共65页利用遗传程序的方式：细胞利用遗传信息完成其功能的机制机制的阐明---是近几十年的科学成就8第8页/共65页例：2012年NatureCellBiology杂志上：在这篇文章中，研究人员构建了Id1-Id3三基因敲除小鼠，发现在Id蛋白表达缺失的情况下，这种转基因小鼠出生后24h内即死亡，其大脑内神经干细胞增殖能力显著下降，而且干细胞的数量也明显减少。

进一步发现Id基因敲除导致Rap1GAP表达升高，而Rap1GAP蛋白抑制Rap1（一种重要的细胞黏附调控因子），导致神经干细胞离开其微环境及细胞分化。这一发现说明Id-Rap1GAP-Rap1信号通路对于神经干细胞黏附于它们所处的特殊的微环境并维持神经干细胞持续不断的自我更新能力起到非常关键的作用。＊Id(inhibitorofdifferentiation,分化抑制物)蛋白属于bHLH（helix-loop-helix,螺旋-环-螺旋)转录因子家族9第9页/共65页3、细胞能够繁衍自身细胞分裂繁殖：分裂前遗传物质复制，每个子细胞获得一套完整而等量的遗传信息如：干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞10第10页/共65页4、细胞获取能量并利用能量太阳的电磁辐射（光能）→光合细胞膜上的吸光素捕获光合作用化学能存于糖类肝释放

血液→细胞→葡萄糖被分解转化为ATP→参与细胞活动11第11页/共65页5、细胞进行各种化学反应细胞犹如微型的化工厂在细胞内发生几乎所有的化学反应都需要酶发生在细胞内化学反应的总和--细胞的代谢12第12页/共65页6、细胞进行多种机械活动物质运输结构组装、去组装细胞移动（肌动蛋白、微管、荧光染色）＊特定蛋白的形状改变引发13第13页/共65页7、细胞能对刺激做出反应受体：细胞具有识别激素、生长因子、胞外基质、其他细胞表面物质的受体；它提供了外界因子引发靶细胞发生特异性应答的通道。做出的反应包括：改变代谢活动（酶）、细胞分裂（复制）、细胞迁移（蛋白）、自我毁灭等14第14页/共65页TNFR和Ｆａｓ介导死亡信号转导15第15页/共65页细胞凋亡受体（Fas）有望成为糖尿病治疗的新靶点

16第16页/共65页ＴＲＡＩＬ与受体结合后能促使细胞凋亡17第17页/共65页8、细胞能够自我调节如果细胞在DNA复制时不能纠错，将产生损伤性的变异；如果细胞生长控制失灵，将导致癌细胞。＊细胞如何调控其活动，而不调节失控？＊分子细胞生物学家主要目标：了解某一特定活动中所涉及的每一组分的结构和作用，组分间相互作用的方式，以及调节相互作用的机制。18第18页/共65页Id(inhibitorofdifferentiation,分化抑制物，转录因子家族敲除缺失，干细胞减少Rap1GAP表达升高Rap1（一种重要的细胞黏附调控因子）被抑制导致神经干细胞离开其微环境及细胞分化（阐明Id-Rap1GAP-Rap1信号通路对于神经干细胞黏附于它们所处的特殊的微环境并维持神经干细胞持续不断的自我更新能力起到非常关键的作用）19第19页/共65页细胞类型原核细胞：细菌、支原体、蓝藻真核细胞：原生生物，真菌，植物，动物相同点：真核由原核进化而来，共享一套遗传语言、共同代谢途径、许多共同的结构特征。20第20页/共65页21第21页/共65页22第22页/共65页不同点：DNA细胞质23第23页/共65页

DNA Pro- Eu-长度 0.25-3mm >4.6mm(yeast)编码蛋白几百-几千 >6200染色体 单个环状，裸露DNA 线性DNA+蛋白质24第24页/共65页细胞质不同点25第25页/共65页原核生物（1-5µm）：古细菌：嗜极端菌（盐、酸、热等）真细菌：支原体，唯一缺乏细胞壁的原核生物多样性：已知物种相关的DNA序列，如编码核糖体RNA的基因，或某些代谢途径的酶，分析海域样本细胞DNA序列，判断物种26第26页/共65页真核细胞的类型（10-30µm）：细胞的转化复杂的单细胞有机体（原生生物）多细胞生物：不同活动由不同类转化细胞完成。如肌肉细胞、肝脏细胞、骨细胞、神经细胞、红细胞、和胃黏膜细胞等。27第27页/共65页＊一套基因，但细胞类型和形状都各不相同。为什么？细胞核中的基因在细胞的一生中有的处于转录状态，即活性状态，有的处于非转录状态，即基因关闭。在生物体的不同发育期，基因的活性是不同的，而且基因的活性有严格的程序。基因活性的严格程序是生命周期稳定的基础。各种不同的生物因其细胞内的基因具有独特的活性调节而呈现不同的形态特征。28第28页/共65页2012年4月：科学家花了廿年观察挪威湖泊一种以水藻为食的微小生物，宣布它是现今世上最古老的有机体之一，同时也是人类最远的亲戚。科学家表示，这种单细胞生物约于十亿年前演化，不算是任何已知的有机体种类，例如动植物、寄生虫、菌类或藻类。奥斯陆大学研究员塔布瑞齐说：我们在这座湖中发现一种不知名的生物分支。它独一无二，尚未发现其他种类的有机体比它更接近生命源头。科学家表示，这种新种类的有机体名为单细胞真核生物（又称有可见细胞核的细胞，Collodictyon）。29第29页/共65页脊椎动物的卵从受精到胚胎发育，上百种细胞分化；每个胚胎细胞的分化途径主要依赖从环境中接受的信号，这些信号反过来又依赖于细胞在胚胎中所处的位置。＊如何在培养皿中控制细胞分化？分化：细胞形态各异，所含物质各不相同，但不同细胞仍由相同的细胞器组成30第30页/共65页模式生物：酿酒酵母：基因数目少；小的单细胞生物易培养；主要以单倍体形式存在，单个基因突变的效应可直接观察，否则，拷贝会掩盖突变基因的存在拟南芥：基因组小，世代时间短线虫：确立的细胞数目，透明体壁，世代时间短果蝇：世代时间短（14d），产卵多，小，便宜，突变品系小鼠：裸鼠无胸腺，不会产生排异斑马鱼：可视性31第31页/共65页结合我们的工作谈谈原核、真核细胞在新药研发中的作用

大肠杆菌ＣＨＯ细胞32第32页/共65页大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。＊表达载体的选择；宿主菌的选择；表达条件的建立；蛋白的纯化33第33页/共65页

哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成为成熟的mRNA，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后加工过程，因而产生的完整抗体和天然抗体一样，具有生物学活性，既可识别抗原又可激活补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有遗传稳定性和可重复性．表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、和生长因子等的大量制备。34第34页/共65页病毒是非细胞类病原体，只能在活细胞中进行繁殖，在细胞外病毒包装成大分子颗粒，由病毒核酸和包被核酸的病毒蛋白质组成病毒感染分两种：（1）毁灭宿主细胞伴随产生病毒后裔（2）将病毒核酸整合到宿主DNA中，这常会改变细胞的活性＊病毒不是主要的生命形式，而更像是源于细胞染色体片段次级进化而来的35第35页/共65页细胞生物学研究方法第一节显微技术一、光学显微镜二、电子显微镜第二节生物化学与分子生物学技术第三节细胞分离技术第四节细胞培养与细胞杂交36第36页/共65页第一节显微技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。37第37页/共65页（一）普通光学显微镜38第38页/共65页（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。39第39页/共65页Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。40第40页/共65页（三）激光共聚焦扫描显微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。41第41页/共65页laserconfocalscanningmicroscope,LCSM42第42页/共65页LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/43第43页/共65页透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM（四）电子显微镜44第44页/共65页45第45页/共65页酵母46第46页/共65页人类精子47第47页/共65页第二节生物化学与分子生物学技术48第48页/共65页一、细胞化学技术cytochemistry二、免疫细胞化学immunocytochemistry三、显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。二、免疫细胞化学immunocytochemistry49第49页/共65页四、放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。50第50页/共65页五、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（insituhybridization）用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。51第51页/共65页（二）Southern杂交／Northern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。52第52页/共65页（三）PCR原理53第53页/共65页第三节流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。54第54页/共65页55第55页/共65页第四节细胞培养与细胞杂交杂交瘤单克隆抗体技术56第56页/共65页细胞增殖与细胞活力检测，细胞凋亡检测（ＦＡＣＳ：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术）；细胞形态检测（显微镜，活体成像）；细胞信号研究，生化与分子生物学技术检测：免疫细胞化学（Ｅｌｉｓａ），显微光谱分析（显微分光光度计），放射自显影技术（同位素标记），分子杂交（原位杂交、Southern）,ＰＣＲ，ＲＮＡ干扰，报告基因。57第57页/共65页基因功能研究方法基因的生物信息学分析

基因序列可以从美国的基因库(GeneSequenceDataBank,GenBank)、基因组序列数据库(GeneSequenceDataBank，GSDB)、欧洲的分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory，EMBL)和日本的DNA数据库(DNADataBankofJapan，DDBJ)中获得。通过序列分析比较工具(如BLASTn、BLASTx)，可以对基因序列资料中各类信息进行识别和比较，寻找序列之间的同源性，得到序列之间的进化关系，建立基因序列结构和功能的关系。58第58页/共65页基因的时空表达谱分析基因的表达在个体发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同，即基因表达的时空性。因此，在研究一个基因的功能前，要对基因的时空表达谱进行分析，包括mRNA和蛋白质两个水平上的基因表达谱分析。mRNA水平的表达谱分析蛋白质水平的表达谱分析基因的功能预测：包括功能学上的预测和结构学上的预测。利用生物信息学的功能预测从结构学方面进行功能预测59第59页/共65页基因功能的实验学验证

（１）基因敲除和敲入技术：敲除：比如有一段"序列""1234567890"(原基因),敲除后为:"1237890",敲入：将基因的密码序列用另一基因密码序列进行替换，以便在体内测定它们是否具有相同的功能，也可