检验课件13.临床微生物

临床病原体检验首都医科大学宣武医院检验科闵嵘教学大纲目的要求1.掌握临床细菌检查的一般方法和标本的正确采集和运送方法。2.熟悉细菌学报告的临床应用。3.了解临床细菌检验和药物敏感性试验的主要方法4.了解临床病毒学检验的基本知识

当今感染性疾病的流行病学特点新传染病陆续被发现（O157出血性肠炎、艾滋病、SARS、疯牛病、艾博拉病、寨卡等三十余种）业已减少的老传染病死灰复燃（结核、梅毒、霍乱）多重耐药菌的出现，导致抗感染治疗的困难。器官移植，抗肿瘤放、化疗降低免疫力使医院感染和条件致病菌感染增加。人们对新传染病认识和准备不足，人群对其尚无免疫力，人类活动范围增大，使感染性疾病传播快，范围广，危害大。临床细菌学检验细菌简介细菌学检查的常用方法细菌学检查的标本采集药敏试验原理及方法一、细菌简介细菌（bacterium）：是属原核生物界的一种单细胞微生物.广义细菌：

包括细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体狭义细菌：

专指其中数量最大、种类最多、具有典型代表性的细菌

细菌的大小与形态一般以微米(m)为大小单位基本形态三种：球菌；杆菌；螺形菌1.球菌：球形或近似球形，直径0.8~1.2μm单球菌双球菌八叠球菌四联球菌链球菌葡萄球菌大杆菌（炭疽杆菌）小杆菌球杆菌中等大杆菌（大肠杆菌）2.杆菌杆状，各种杆菌大小、长短与粗细差异较大3.

螺形菌菌体弯曲（分弧菌、螺菌和螺杆菌）弧菌螺菌螺杆菌社区性感染与医院内感染

社区性感染医院内感染病原菌类型多为致病菌多为条件致病菌或非致病菌致病力强弱耐药株少见大多耐药，且为多重耐药宿主免疫情况正常/稍减低低下疾病症状特点典型不典型预后病程短，一般无遗留病程迁延，好转缓慢或潜伏二、细菌学检查的常用方法制作涂片和染色、观察形态。（常用革兰氏染色、抗酸染色）培养鉴定及药物敏感试验。免疫学检查分子生物学细菌感染的检查方法染色法革兰染色法：结晶紫碘液95%乙醇复红抗酸染色：石炭酸复红3%盐酸酒精美兰其它特殊染色革兰阳性

革兰阴性抗酸染色1min1min脱色5min脱色普通光学显微镜

普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。革兰氏染色的应用

1、革兰阳性细菌：不被乙醇脱色仍保留紫色为革兰阳性菌(G+菌)，如葡萄球菌、链球菌等。

2、革兰阴性细菌：若被乙醇脱色后再被复染成红色者，为革兰阴性菌(G-菌)，如大肠埃希菌、伤寒沙门菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。病例患者刘××，男，21岁，11月15日发热（>38ºC）剧烈头痛、16日出现喷射状呕吐，到我院急诊科就诊，下午出现语言不清。3年前有颅底骨折，脑脊液鼻漏病史。行腰椎穿刺取脑脊液送检验科：常规WBC：3240×106/L、多核65%

生化蛋白150g/dl、糖1mg/dl细菌学检查结果经细胞离心机涂片，革兰染色，可见大量革兰氏阴性杆菌。培养鉴定结果：肺炎克雷伯菌药敏结果：除氨苄西林耐药外，其他抗生素都敏感，ESBL(-)。诊断化脓性脑膜炎判断依据：脑脊液WBC计数及分类、生化确诊依据：脑脊液中发现大量革兰阴性杆菌治疗：罗氏芬+依替米星电子显微镜电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。肺炎链球菌荚膜荚膜分离培养①混浊生长②沉淀生长③表面生长菌膜菌沉淀均匀浑浊对照1.在液体培养基中的生长现象细菌在培养基中的生长情况细菌在固体培养基中的生长情况光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落细菌的生化鉴定病例患者曾×，男，26岁，因高热寒战3日入院，后出现弛张热，皮肤出血点，肝脾肿大，血像WBC22×109/L，核左移，有中毒颗粒，拟诊败血症。于发冷时8次血培养均（-），使用万古霉素+泰能治疗一周无效。诊断会诊后决定行骨髓培养发现似奴卡氏菌的硬菌落送中科院微生物所鉴定为金色荚膜链球菌，仅对磺胺敏感，改用磺胺治疗一周出院。该菌为海产品感染引起，可引发疯鱼病。患者病前三周曾做金龙鱼标本，刺伤手指，发病时伤口已愈合。细菌鉴定的新技术质谱技术:质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。16SrRNA为代表的分子生物学技术在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。病例

空间罗氏菌血流感染男性，37岁，因“间断性发热3个月”入院。多于夜间出现，体温最高达39.8℃，偶有咳嗽，不伴寒战，到北京某医院胸片检查未见异常，诊断为“上感”，给予头孢类抗生素输液治疗后体温降至正常。之后多次间断出现体温升高，给予抗炎及退热治疗效果欠佳。1个月前，患者出现眼部肿胀、牙痛、口唇肿痛及头疼等症状，来我院就诊，给予拉氧头孢钠抗炎治疗后，患者仍间断体温升高。查体：主动脉瓣区可闻及收缩期杂音，可触及水冲脉，毛细血管搏动征阴性。血常规示白细胞计数10.71×109/L，中性粒细胞计数8.51×109/L。CRP:96.50mg/L，ESR：59mm/h。心脏彩超示先天性心脏病；主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣二尖瓣化畸形，主动脉瓣脱垂，主动脉瓣反流。心脏MRI示主动脉瓣返流，主动脉瓣形态欠规则。胸部CT示双侧胸腔少量积液，心包少量积液。入院后每于发热时抽取血培养（5次），其中3次需氧血培养阳性，涂片镜检为革兰阳性杆菌，放线菌属报告临床；厌氧血培养均阴性。药敏结果示青霉素、头孢类、喹诺酮类、碳青酶烯类、四环素类、磺胺类、万古霉素等抗菌药物均为敏感。既往史：对磺胺类药物过敏。临床根据患者症状、体征及血培养结果，诊断为“菌血症，感染性心内膜炎？”，给予氨苄西林舒巴坦1.5gq8h治疗，患者体温降至正常，3天后体温再次升高达38.5℃，抽血培养阴性，改为氨苄西林舒巴坦1.5gq6h治疗2周，复查3次血培养阴性，出院。病例

空间罗氏菌血流感染病例1病原菌的鉴定1VITEKCOMPACT鉴定率低为麦氏放线菌、丙酸丙酸杆菌和小棒状杆菌；2质谱仪鉴定为空间罗氏菌（rothiaaeria）；316SrRNA鉴定为空间罗氏菌（aeriarothia）。病例16SrRNA鉴定细菌通用引物（1500bp）正向（27F）:5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,反向(1492R):5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’BLAST程序比对，Rothiaaeria鉴定率为99%MEGA5.0软件中NeighborJoining方法构建系统发育树，如下：RothiaaeriaGenbank：KF691779病例讨论VITEK2Compact自动化鉴定系统数据库中只包含黏滑罗氏菌，已有的API试剂中的APICoryne试剂条仅能鉴定罗氏菌属中的龋齿罗氏菌，因此造成了未能给出空间罗氏菌的鉴定结果。质谱仪(MODI-TOF-MS)和16SrRNA可鉴定空间罗氏菌。16SrRNA序列测定体现不同菌属之间的差异成为了理想的基因鉴定靶序列，为鉴定该菌较好的方法，是目前细菌分类和鉴定的重要手段。三、细菌学检查的标本采集基本原则（一）采集标本前局部应做好准备工作，标本必须直接采自病变部位。尽可能在合适的时间采集。例如：清晨的痰和尿液含菌量较多，故是采集的最佳时间。了解感染性疾病的自然过程有助于决定采集何种标本及采集时间。必要的免疫学知识对解释血清学结果十分有用。应尽量采集足量的标本送实验室。例如：成人的血培养标本每次宜采集10ml以上。基本原则（二）使用合适器械及运送容器很重要，所有标本都应使用无菌容器；棉拭子常与运送培养基配合使用，但棉拭子不宜用作厌氧菌培养。任何送厌氧培养的标本应做到在厌氧环境下运送。培养标本尽可能在应用抗菌药物前采集，解释培养结果时也应考虑抗菌药物使用史。有些细菌如淋病奈瑟球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌等对抗菌药物非常敏感。对送检标本有特殊要求时，应在化验单上清楚标明，或直接与实验室联系。常见标本的采集和运送要求：1.血液及骨髓 发热初期或发热高峰在抗菌药物治疗之前 5-10ml 1-4次/24h2.脓汁及病灶分泌物 及时送检 3.痰 晨痰为好 漱口可减少口腔菌的污染4.咽拭子、鼻拭 晨起为好用药之前 病变处5.尿 中段尿 ≤1h接种6.粪便 自然排便 可使用直肠拭子（肛拭）7.C.S.F 立即送检（脑膜炎双球菌离体后迅速自溶）不可低温保存8.胆汁 无菌操作 立即送检9.穿刺液、胸腹水、心包液、关节液等，及时送检需氧和厌氧血培养瓶血培养标本采集流程四、药敏试验原理及方法1、药敏试验概念：

药敏试验：测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验。

药敏试验有的以最低抑菌浓度(MIC)、有的以最低杀菌浓度(MBC)作为判定结果的标准。

MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是18－24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。2、药敏试验的指征：⑴已查明的病原菌⑵为进行细菌耐药性检测和了解本地区细菌耐药性变迁⑶新抗菌药物的药效学评价，必须进行药敏测定，以获得该药的MIC50和MIC90，MBC50和MBC90等评价指标。3、常用药敏试验方法：⑴纸片扩散法：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内由纸片中心向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受抑，经过18~24小时的培养后形成抑菌圈，其直径大小与药物浓度的对数呈线形关系。判断标准遵循CLSI折点标准。M-H平皿 直径90mm琼脂厚度4mmKB纸片法的操作步骤：⑵稀释法：（MIC/MBC测定）以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释)，经培养后观察最低抑菌浓度。包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。⑶E-test法：将抗菌药物按双稀释倍放置于5mm×50mm塑料载体上，操作步骤同琼脂扩散法（4）自动化药敏测定仪：基本原理-----利用光学测量法测定抗菌药物对细菌的作用。几种重要耐药菌株检测的临床意义1.MRSA/MRSE/MRSCN（耐甲氧西林的…）2.VRE（耐万古霉素的肠球菌）3.PRSP（耐青霉素的肺炎链球菌）4.鲍曼不动杆菌（多重耐药）5.铜绿假单胞菌（多重耐药）6.嗜麦芽窄食单胞菌（多重耐药）7.产ESBLs的E.coli和K.pneumonia8.VRSA？（对万古霉素低度耐药的金葡菌？）9.产NDM1的肠杆菌科细菌。（泛耐药）临床病毒学检验病毒的基本特性标本的采集与送检病毒的分离培养与鉴定病毒的形态学检查病毒感染的血清学诊断检测病毒核酸巴西卫生部2016年1月12日通报，

可能与寨卡病毒感染有关的小头畸形病例356例3000BC，埃及孟非思壁画中长老患小儿麻痹症。病毒的危害1、微生物引起的疾病中，病毒占75%2、有些病毒传染性强，如乙肝V、流感V、HIV等3、可累及多系统：呼吸道、消化道、心血管、神经系统等4、很多病毒缺乏有效的治疗药物。一、病毒的基本特性病毒（virus）：最微小的、结构最简单的非细胞型微生物。特征1.体积微小；

2.非细胞结构，结构简单“一包基因”而且仅一种核酸；

3.严格的胞内寄生；

4.以复制方式繁殖；

5.抵抗力特殊；

6.在医学微生物中占重要地位。葡萄球菌(1000nm）牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体

(65×95nm)B、腺病毒

(70nm)C、脊髓灰质炎病毒

(30nm)D、乙脑病毒

(40nm)E、蛋白分子

(10nm)F、流感病毒

(100nm)G、烟草花叶病毒病毒形态二、标本的采集与送检

（principleofcollectionspecimen）

1、采集急性期标本2、污染标本应用抗生素抑制标本中细菌或真菌的生长3、低温保存，快速送检4、血清学实验检查抗体（双分血清）三、病毒的分离培养与鉴定

（virusisolationanddetermination）动物接种选择易感动物及接种部位，观察发病情况鸡胚培养不同病毒选择不同接种部位（绒毛尿囊膜，尿囊腔，羊膜腔，卵黄囊），分离流感病毒最常用。细胞培养：分离病毒最常用的方法（1）原代细胞—来源于动物、鸡胚、人胚组织细胞，对多种病毒敏感，但只能传2-3代。（2）二倍体细胞—在体外分裂50-100代后仍保持2倍体染色体数目的单层细胞。（3）传代细胞—能在体外无限传代的细胞多由癌细胞或二倍体细胞突变而来。四、病毒的形态学检查

电镜和免疫电镜——直接观察病毒光镜——大病毒和包涵体流感病毒的荧光电镜照片乙脑病毒的电镜