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黑DB23龙江省地方标准DBT022黑龙江省市场监督管理局发布前言T请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。起草单位：黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所。大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术规程用于外源接种大豆根瘤菌的效果评价。范性引用文件，GBT19495.2转基因产品检测实验室技术要求GBT19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法NY/T2066-2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应(PCR)法定义特定根瘤菌株接种豆科植物与土著根瘤菌竞争结瘤,在竞争中特定根瘤菌结瘤数占总瘤数的百力活性和植株全氮含量来评价。结瘤能力评价4.1一般要求全GBT。4.2原理利用BOX-PCR指纹图谱比较，检测接种根瘤菌菌株的占瘤率，以此评价供试菌株相对于土著根瘤菌.3主要材料与用具铁锹、小铲、镊子、记号笔、塑料袋、剪刀、冰盒、小型离心机、微量可调移液器及对应的无菌4.4占瘤率测定方法4.4.1蛭石盆栽实验中根瘤菌占瘤率的测定a子的处理n水洗3次后置于1%水琼脂培养基上培养，待其萌芽后种植于灭菌的蛭石中，进行蛭石盆栽培养，每盆3粒~4粒大豆种子。b根瘤菌接种菌生理盐水的大豆为阴性对照。c菌体蛭石盆栽培养45d后收获根瘤，每个盆中随机挑取3个~5个根瘤，分别用75%乙醇消毒1min、15%DNA在上述收获的类菌体中加入10μL无菌水充分悬浮类菌体，混匀后于沸水中煮沸5min，然后迅速ARA4中的规定执行，BOX-PCR扩增体系及扩增反应程序见附录B。FPCRNYT11中5.6和6.2规定的方法进行检测与判定。4.4.2土壤盆栽试验中根瘤菌占瘤率的测定消毒，无菌水清洗后，按照上述方法进行BOX-PCR扩增及图谱分析。4.4.3结果分析对比分离根瘤菌与接种菌种的BOX-PCR指纹图谱，达到100%相似水平时即可定位同一类BOX图谱类效果评价.1材料与工具.2固氮酶活性测定立即用异丁基胶塞密封，然后按瓶子中气相体积用注射器从瓶中抽空5%~10%的空气，再用注射器注入酶活性。计算公式如下： U=Unmolmg/h；m——根瘤鲜重mg；5.3全氮含量测定m(V3V)1000Wg/kg；c液的浓度0.01moL/L；V滴定消耗标准液量mL；V滴定消耗标准液量mL；V试液量10mL；m——样品质量g；V0mL；——氮的毫摩尔质量g/mmoL。(规范性)方NaCl0.1g；0.25%溴麝香草酚蓝(仅在从根瘤中分离根瘤菌时选择性的加入)，1mL；琼脂，15g~18g；蒸馏水，1000mL；pH值，6.8~7.0。(规范性)TACGGCAAGGCGACGCTGACGB.2扩增体系为25.0μLdNTPmmolLLDMSO2.5μL；BOX

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