第四章工业发酵灭菌

1、在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？2、为防止杂菌的污染，哪些物品须要灭菌？培育基、发酵设备、空气、管道、流加料等3、什么时候进行灭菌？生产菌接种前常用灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）、过滤除菌；1、干热灭菌法灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热主要用于保持干燥的物料、器具等.常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h原理：依据氧化作用导致微生物死亡。2、湿热灭菌法原理：借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特殊是氢键受到破坏，引起不行逆的变性，使微生物死亡。灭菌条件：121℃，30min。适用范围：广泛应用于生产设备及培育基的灭菌例：高压灭菌锅湿热灭菌的原理湿热灭菌的优点：1）蒸汽来源简洁，操作费用低廉，本身无毒2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌4）蒸汽输送可借助本身的压强，调整便利，技术管理简洁缺点：1)设备费用高2）不能用于怕受潮的物料灭菌3、射线灭菌紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线适用范围：无菌室、培育间问题：是否适于固体、液体物料灭菌？波长范围？4、化学药品灭菌法（1）第一大类：表面消毒剂高锰酸钾溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛37％、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类。（作用原理？适用范围？）（2）其次大类：抗代谢药物化学结构与微生物必需的代谢物类似物例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大类：抗生素不同种类其作用不同，要有针对性选择。适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒

1、湿热灭菌中的相关定义致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间；在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。三、加热灭菌的原理问题说说芽孢或孢子的热阻要比养分细胞的热阻大的缘由？芽孢或孢子的热阻要比生长期养分细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较养分细胞低（特殊是游离水分少），也是芽孢耐热强的一个缘由。芽孢与养分细胞的耐受力，哪个强？一级反应：用N表示残留活菌个数，则活菌的削减率（死亡率），与N呈线性关系，即：式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过试验才能测定。2、微生物的热致死动力学：对数残留定律积分边界条件：N0→Nθ；t0=0式中，θ灭菌时间（s）；N0灭菌起先时，培育基中杂菌个数（个）；Nθ经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。灭菌时间与哪些因素有关？051025121116110108从上述的微生物对数死亡规律可知，假如要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不行能的。工程上，在进行灭菌的设计时，常认为Nθ=0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败。3、热致死反应的速度常数K

K是表达微生物耐热性的特征常数，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热。温度越低，K值越小。

例：

在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03s-1，请问哪一种微生物更耐热？培育基灭菌的要求：达到要求的无菌程度（10-3）尽量削减养分成分的破坏，在灭菌过程中，培育基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培育基中不同养分成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。4、灭菌的温度和时间培育基湿热灭菌需解决的工程问题将培育基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），须要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热灭死动力学反应器的形式和操作方式培育基中有效成分受热破坏的可接受范围A---比例常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---确定温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。如何选择一个既能满足灭菌须要，又可使培育基的破坏尽可能减小的灭菌工艺条件？微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：（5）1/TK（min-1）K和A的求解：K`---培育基内易被破坏成分的分解速率常数；A`---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---确定温度，K；ΔE`---培育基成分分解所需活化能，J/mol。灭菌时，培育基成分分解速率常数K`与温度之间的关系也可用阿累尼乌斯公式表示：当培育基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培育基的分解有如下关系：

即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培育基成分的破坏速率的增加倍数。结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培育基成分的破坏速率的增加。灭菌时杀死微生物的活化能大于培育基成分的破坏活化能值，因此：由此可见，若要削减养分成分的破坏，可上升温度灭菌。结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到须要的灭菌程度，同时又可削减养分物质的损失。问题

灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以接受，一种是118℃灭菌15min，另一种是128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？答：从理论探讨和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培育基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的上升而加速，但微生物的死亡速率随温度的上升更为显著。因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到须要的灭菌程度，同时又可削减养分物质的损失。四、影响培育基灭菌的其他因素培育基成分、pH值、培育基中的颗粒、泡沫五、分批灭菌和连续灭菌（一）、分批灭菌

24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温发酵罐过程包括：升温（后期灭菌）、保温顺冷却（初期灭菌）等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%右图为培育基间歇灭菌过程中温度变更状况。1、定义：将配制好的培育基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培育基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）2、灭菌时间的计算

假如不计升温阶段所杀灭的菌数，把培育基中全部的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简洁地利用右式，粗略地求得灭菌所需的时间：例：有一发酵罐内装40m3培育基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所须要的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012（个）、Nt=0.001（个）K=1.8min-1

但是事实上，培育基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特殊是当培育基加热到100℃以上，这个作用较为显著。因此，保温灭菌时间事实上比上述计算的要短。严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑。3、分批灭菌的操作

分批灭菌是在所用的发酵罐或其他培育装置中进行的，它是在配制罐中配好培育基后，通过专用管道输入发酵罐等培育设备中，然后起先灭菌。在进行培育基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培育装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。起先灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培育基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培育基温度升到70℃左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120℃，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排气，当然在保温过程中，应留意凡在培育基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。3、分批灭菌的操作保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培育基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培育。间歇培育特点：由于培育基的间歇灭菌不须要特地的灭菌设备，投资少，对设备要求简洁，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果牢靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂常常接受的一种培育基灭菌方法。4保证间歇灭菌成功的要素内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置牢靠，蛇管无穿孔现象压力稳定的蒸汽合理的操作方法。发酵罐的接管图4、分批灭菌的留意事项1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要猛烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。2）排气量不宜过大，以节约蒸汽3）灭菌将要结束时，应马上引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避开罐压快速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。4）在引入无菌空气前，罐内压力必需低于过滤器压力，否则培育基将倒流入过滤器。（二）、连续灭菌

1、定义：

将配制好的培育基在向发酵罐等培育装置输送的同时进行加热、保温顺冷却而进行灭菌。连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70℃，以避开连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液快速接触混和，并使料液的温度很快上升到灭菌温度（126-132℃）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般接受冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃后，输送到预先已经灭菌过的罐内。发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵加热塔维持罐冷却管

连续灭菌的基本设备有哪些？问题2、连续灭菌的优点：1）可以接受高温短时灭菌；2）发酵罐利用率高；3）蒸汽负荷均衡；4）热效率高；5）可接受自动限制，降低劳动强度；3、连续灭菌时间的计算

假如不计升温阶段所杀灭的菌数，把培育基中全部的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简洁地利用右式，粗略地求得灭菌所需的时间：4、连续灭菌流程

六、间歇灭菌与连续灭菌的比较

灭菌方式优点缺点连续灭菌1.

灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失2.

操作条件恒定，灭菌质量稳定3.

易于实现管道化和自控操作4.

避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率5.

发酵设备利用率高1.

对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置2.

操作较麻烦3.

染菌的机会较多4.

不适合于含大量固体物料的灭菌5.

对蒸汽的要求高间歇灭菌1.

设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置2.

操作要求低，适于手动操作3.

适合于小批量生产规模4.

适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1.

培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降2.

需进行反复的加热和冷却，能耗较高3.

不适合于大规模生产过程的灭菌4.

发酵罐的利用率较低加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点特别明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培育基的灭菌。七、培育基与设备、管道灭菌条件1、灭菌锅内灭菌2、种子培育基实罐灭菌3、发酵培育基实罐灭菌4、发酵培育基连续灭菌5、消泡剂灭菌6、补料实罐灭菌7、尿素溶液灭菌谢谢！［例3-1］［例3-1］有發酵培養基40m3，原始污染程度為105個菌/mL，要求無菌程度Ns為10-3個菌/批，若滅菌溫度125℃時滅菌速度常數為1min-1，求所须要滅菌時間。解：已知N0=40×106×105=4×1012個菌/批Ns=10-3個菌/批K=1min-1將