甘露聚糖肽特性

甘露聚糖肽一甘露聚糖肽发现甘露聚糖肽(Mannatide),曾用名多抗甲素(PolyactinA,PAA)。是我国首创的一种新型免疫增强剂，是从健康人口腔分离的一株a-溶血性链球菌(a-hemolyticStreptococcui)33#菌株经深层培养,发酵提取而得到的一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的多糖类物质。它是由原西安医科大学方亮教授在克山病的研究中发现的,于1976年从链球菌的代谢产物中提取的多糖类物质,初步试验有抗肿瘤作用,临床预期有一定效果。1976年国家医药管理局安排四川抗菌素研究所，在方亮教授的指导下和初步工作的基础上，开展了菌种筛选获得了a—甘露聚糖肽产生菌33#菌株,并对菌种生理生化特性、血清型分类、深层培养和提取工艺、理化特性、化学组成、毒性和药理用量标准等方面进行了系统的研究、试验。二甘露聚糖肽的化学构造及理化特性a—甘露聚糖肽的化学结构式如下：分子量为71,700kD,是具有一定均一性的混合物，不存在单糖、双糖等小分子糖类和游离氨基酸，完全由不同链长的甘露聚糖肽分子构成。a—甘露聚糖肽的总糖含量为87.7〜90.3%，主要为甘露糖以及少量的葡萄糖残基，二者之比约为39:1；蛋白质含量为4.5〜6.2％主要的构成氨基酸为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸，其比例为1：2：2：1：1：1；此外还有少量的甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸等。甘露聚糖以B-(1-4)键连接组成甘露聚糖肽的糖主链且甘露聚糖肽的糖链还存在1-6、1-2等支链结合方式和还原末端。甘露聚糖肽中糖链与肽链的连接有两种方式N-糖苷键连接和0-糖苷键连接。在0-糖苷键连接的结构中，主要是糖链还原末端的甘露糖基，以糖苷键形式通过肽键上的羟基氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸)的羟基氧与甘露聚糖连接，组成聚糖肽。N-糖苷键连接的结构中，糖链还原末端可以与肽链中的赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的氨基连接。a—甘露聚糖肽为类白色或微黄色无定形粉末、无臭、无味；易溶于水，不溶于有机溶剂如甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、氯仿、正己烷等；化学性质稳定。三a—甘露聚糖肽的生物活性由于a—甘露聚糖肽中的寡糖和氨基酸残基数变动很大，再加上其复杂的残基连接方式，使得a—甘露聚糖肽具有明显的免疫活性。当a—甘露聚糖肽通过凝集素与巨噬细胞上的受体结合后，巨噬细胞被激活，增强网状内皮系统(RES)吞噬活性，能刺激脾脏淋巴细胞增生，能直接作用于中枢免疫器官胸腺，并能诱导机体产生一系列的细胞免疫和体液免疫反应，增强动物体的非特异性免疫功能，提高各类动物对一般疾病和各种病原性细菌、病毒等的抵抗力，能最大限度地减少各种疾病和细菌病毒对动物的不利影响。⑵.a—甘露聚糖肽能促进免疫细胞活化增殖及特异抗体生成，提高外周血白细胞数，显著增强动物对各种环境的应激机能。⑶.a—甘露聚糖肽能很好的治疗动物各种原因所致的再生障碍性贫血，促进造血干细胞生长。⑷.a—甘露聚糖肽能增强粘膜免疫系统修复防御功能，显著提高粘膜系统创伤修复能力，改善粘膜免疫系统调节功能。⑸•具有特殊的抗菌效果，吸附并抑制肠道内病原菌群定植和生长，促进肠道内有益菌增殖。⑹.a—甘露聚糖肽具有抑制肿瘤细胞生长与代谢的作用。⑺•对动物的关节肿有明显的治疗效果。四a—甘露聚糖肽的作用机理a—甘露聚糖肽进入消化道后，被消化酶分解为甘露聚糖(低聚甘露糖)和碱性多肽两部分，而甘露聚糖经相应酶的不完全水解产生甘露寡糖(MOS)，通过这几种生物活性物质而发生作用。甘露聚糖(低聚甘露寡糖)的功能吸附病原菌甘露聚糖吸附病原菌研究结果发现于1980年末所做的甘露聚糖抑制肉鸡沙门氏菌感染能力的研究。当大肠杆菌或沙门氏菌与低聚甘露糖一起培养时发现凝集现象，干扰了肠道病原菌的定植，从而打断了病原菌附着—繁殖-致病的途径，并携带病原菌排出体外。原因是寡聚糖与病原菌产生外源凝集素结合，防止微生物在胃肠道上皮的附着。凝聚素与糖分子的结合具有高度的特异性。2•为有益菌提供营养MOS因其特有的糖苷键(a—1,4糖苷键)不能被动物消化酶消化利用，肠道内的有益菌(双歧杆菌和乳酸菌)却能很好利用MOS而能大量繁殖；相反，大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌则不能利用MOS,使其饥饿而死。Yasuis(1992)试验证实，某些双歧杆菌可以诱导分泌免疫球蛋白A的分泌。3•调节免疫机能甘露聚糖分子中含有磷酸成分。研究表明甘露聚糖中的磷酸含量较高时，对结合病原菌是不利的，但对免疫调节功能则是重要的。试验证明低聚甘露糖对巨嗜细胞和单核细胞有积极影响，增强其吞噬作用；提高血清中溶菌酶水平；刺激肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)和一氧化氮(NO)水平升高。TNF能抑制肿瘤细胞；IL和IFN是具有免疫活性的内源性肽，两者都可以激活或调节免疫应答中心；NO由巨嗜细胞产生，而NO具有直接杀伤肿瘤细胞的作用。4•结合霉菌毒素霉菌毒素由需氧菌产生，是动物营养的最大挑战之一，而酯代葡甘露聚糖(Esterifiedglucomannas)是一种较好的霉菌素结合剂。Diaz[140]在奶牛精料混合物中添加500g/t的甘露聚糖可以使奶中的黄曲霉素水平下降，从而减少霉菌素对人和动物的毒副作用降低霉菌素的免疫抑制作用。5•改善营养物质的消化吸收MOS通过发酵产生短链脂肪酸，降低pH值，抑制有害菌生长，同时也刺激消化道的蠕动，而且通过微生物区系的改变而改变肠道形态(肠绒毛高度、腺窝深度)，更加有利于营养物质的消化吸收。Newman等报道，在1〜35日龄犊牛的奶中添加MOS时，生长速度提高8%,采食量提高10%。碱性多肽的功能肽不仅是机体蛋白质代谢的底物，而且还具有其他重要的生物学作用。碱性多肽能作用于革兰氏阳性菌的细胞成份一一肽聚糖，切断连接N—乙酰葡胺和N—乙酰胞壁酸的聚糖链，丧失其坚韧性，使细菌发生低渗透型的裂解，从而杀伤细菌。肽还有促进巨嗜细胞的吞噬作用，促进淋巴细胞和脾细胞的增殖作用，从而增强机体免疫力。由于多抗甲素具有很广的应用前景，对其药理和临床研究力度在最近6、7年得到加强，并取得了突破性进展，对原先观察到的功能进行了机制上的进一步解释，主要包括以下6个方面。调整巨噬细胞功能刘晓波网等的研究结果表明，多抗甲素能增强在淀粉或硫代乙醇酸钠刺激下获得免疫应答能力而表达吞噬功能的小鼠巨噬细胞的吞噬功能，且表现出浓度依赖性(0.5mg/L)。如诱导T细胞和B细胞的功能活化，增加天然杀伤细胞(NK)功能活性，因而表现出显著的抗肿瘤作用。最近的研究还发现，多抗甲素可以诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮(NO)。生理状态下，巨噬细胞产生的NO可以起到免疫调节的作用，在一些诱导剂作用下，巨噬细胞则可产生大量的NO,并对外源性抗原及肿瘤细胞等起到杀伤作用。向大鼠腹腔内注射a—甘露聚糖肽2天后，其腹腔内巨噬细胞数量、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)的活性、吞噬活力、NO的分泌以及细胞毒性均随着甘露聚糖肽剂量的增加而增加,同时大网膜乳斑的数量和面积也显著增加。表明腹腔内注射甘露聚糖肽增强了腹腔巨噬细胞的免疫功能。对人天然杀伤细胞活性的作用天然杀伤细胞在体内可抑制肿瘤的发生、发展和转移，是机体执行免疫监视功能的重要效应细胞。恶性肿瘤患者天然杀伤细胞的活性降低可能是肿瘤发生和发展的重要因素之一。强文安等应用单细胞细胞毒试验及形态学观察的方法，研究了多抗甲素对人体天然伤细胞的作用机制。结果表明，多抗甲素能增强食道癌患者淋巴细胞明显低下的结合率和杀伤率。由于多抗甲素能增加人外周血淋巴细胞IL-2的生长和适应性，而IL-2和干扰素洲又能通过直接激活与靶细胞结合。经多抗甲素预处理的效应细胞似无促进天然杀伤细胞与靶细胞的结合，但可能促进了未成熟天然杀伤细胞释放淋巴细胞颗粒或某种可溶性细胞溶解因子，使靶细胞遭受致死性损伤，导致溶解。对人淋巴细胞免疫功能的影响在应用多抗甲素治疗后，细胞免疫功能迅速改善，3H-胸甘及14C-尿甘的参入计数明显高于治疗前，表明多抗甲素改善和调节了肿瘤病人淋巴细胞的免疫功能。另外，随着多抗甲素剂量的增加，淋巴细胞的参入计数也相应的增加，在多抗甲素剂量为10mg/L时，3H-胸甘及14C-尿甘的参入计数达到最高值；而当多抗甲素剂量增至50〜100mg/L时，3H-胸甘及14C-尿甘的参入计数明显低于对照组;在剂量为50mg/L时，刺激作用减小;当剂量增至100mg/L时，其对淋巴细胞DNA及RNA的合成功能呈现抑制作用。对淋巴因子活化的杀伤细胞增殖抑制及杀伤活性的影响淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)/IL-2疗法是一种有效的肿瘤生物治疗方法，对某些类型的肿瘤有良好的疗效，但是需要相当数量的效应细胞辅以大剂量的IL-2,代价昂贵，不良反应大，因而其推广受到限制。由于多抗甲素成本相对较低，又无明显不良反应，本身又是一种生物反应调节剂，因此临床上可望将多抗甲素与LAK/IL-2疗法联合应用，以降低IL-2的服用量并减少其不良反应。增强特异性细胞毒T细胞活性体外研究发现，用多抗甲素共育外周血单个核细胞可增强其天然杀伤性细胞活性和巨噬细胞的细胞毒性价。最近的研究发现用多抗乙素治疗S180肉瘤荷瘤小鼠后，其肿瘤特异性细胞毒性可明显增强，而对天然杀伤性细胞敏感细胞株K562的杀伤活性则无明显的增强。这可能是由于多抗乙素增强了荷瘤小鼠的细胞免疫而使肿瘤生长缓慢所致。有关特异性细胞毒T细胞的活化可能来自于巨噬细胞和天然杀伤性细胞产生的IL-1、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞活性物质或细胞间的直接作用。这些细胞活化后，其抑制和杀伤肿瘤作用可进一步放大增强。对动物红细胞变性能力和免疫功能的影响肿瘤血行性转移是一个非常复杂的过程，影响肿瘤转移的因素也比较多，目前研究认为主要与机体血凝状态私免疫功能等因素有关。Holm等认为血小板聚集受血栓素A2-前列腺环素的比例所控制，提示多抗甲素可能与通过影响血栓素A2/前列腺环素比值而抑制肿瘤转移的可能性较小侧。另一方面,siegel也曾推测红细胞在阻止癌细胞血行性转移方面有重要作用，可通过C3b受体粘附己激活的粘附补体的肿瘤细胞，从而增强吞噬细胞的吞噬、降解作用，防止癌细胞的血行性转移。实验证明，多抗甲素可使荷瘤小鼠红细胞免疫功能全面上升。唐玉等卿的研究还发现多抗甲素可加速红细胞的滤过速度，改善红细胞的变形能力，降低血液粘稠度，促进动脉粥样硬化等疾病的痊愈。甘露聚糖肽通过以下三种方式增强腹腔巨噬细胞杀伤癌细胞作用:诱导大量巨噬细胞进入腹腔;增强这些细胞的吞噬、清除能力;增强巨噬细胞的非接触性细胞杀伤性。甘露聚糖肽能够激活巨噬细胞,并诱导机体产生一系列细胞免疫和体液免疫反应,增强动物体的非特异性免疫功能,提高各类动物对一般疾病和各种病原性细菌、病毒等的抵抗力,最大限度地减少各种疾病和细菌、病毒对动物的不利影响。甘露聚糖肽能显著增强动物对各种环境的应激机能。食用甘露聚糖肽后,在恶劣的环境刺激下能显著增加肾上腺中维生素C（VC）含量，使肝糖元增加，而SGPT显著降低，从而使动物在高温和低温下都能很好地保持正常的生理水平,最大限度地减少恶劣环境对动物的负面影响而正常快速地生长;甘露聚糖肽具有特殊的抗菌效果,能吸附并抑制肠道内病原菌群定植和生长,促进肠道内有益菌增殖;甘露聚糖肽对动物的关节肿大也有明显的治疗效果,在动物试验中可明显减轻蛋清法引起的急性关节肿和甲醛引起的亚急性关节肿,治疗效果比高剂量水杨酸注射治疗更明显。五a—甘露聚糖肽的生物合成5．1菌种:甲型溶血性链球菌33#株5.2将冻干管的菌种接入试管液体培养基中，在30°C下，培养18~24h,经无菌考查和形态学鉴定合格后再接入新鲜肉汤培养基试管中,30C培养18~24h,反复两次。挑选生长旺盛、活力强、形态特征等符合要求的菌种,冰箱保存。5.3将优良的试管液体菌种,按0.2%的接种量在无菌条件下接入摇瓶培养基中,静置37C下,培养24h,镜检,长势良好,无杂菌。5.4按0.2%的接种量在无菌条件下接入发酵培养基中，静置37C下，培养65~70h。镜检,染色开始变浅,盘绕球链开始部分断裂,还原糖、氨基氮消耗将尽时,水浴80C30min灭活。5.5最适合菌株产甘露聚糖肽的培养基配方为葡萄糖15%、蛋白胨3%、酵母膏7%、氯化钠5%、pH7.2。接种量2%,37C静置培养65~70h,发酵液中甘露聚糖肽的含量可达到90mg/100mL,提高了甘露聚糖肽产物的得率,达到了优化培养基目的。在培养过程中，酵母膏影响最大,葡萄糖其次,而蛋白胨影响最小。六a—甘露聚糖肽生产企业原料药生产厂家：上海金宇生物科技内乡制药有限公司（批准日期：2010-10-26）（9家）成都利尔药业有限公司（批准日期：2010-4-21）国药集团川抗制药有限公司（批准日期：2009-12-14）浙江瑞帮药业有限公司（批准日期：2003-3-25）广东宏远集团药业有限公司（批准日期：2002-12-16）西安交大瑞鑫药业有限公司（批准日期：2002-10-16）西安亨通光华制药有限公司（批准日期：2002-09-13）齐鲁制药有限公司（批准日期：2002-07-10）龙泉市辰龙药业有限公司（批准日期：2002-07-10）资料来自国家食品药品监督管理局（2011-6-13）成都利尔药业有限公司企业简介成都利尔药业有限公司主要产品有国内首创的新型免疫增强药a-甘露聚糖肽（多抗甲素）系列产品及高科技微生态制剂促菌生片等，共有医用原料药、注射液、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、酊剂等七大类数十个品种。特别是甘露聚糖肽系列产品为全国独家首创，继85年与抗菌素工业研究所共同申请到原料药和针剂产品的生产批文后，又陆续研制开发出片剂、口服液、胶囊三种剂型，到目前为止，甘露聚糖肽是我公司在全国唯一生产的厂家。七a—甘露聚糖肽原料药价格2000元/公斤含量三80%。八a—甘露聚糖肽临床使用疗效81a—甘露聚糖肽对鲫鱼生长性能影响以0.75—3.00mg/kg为测定最佳使用剂量的范围，其中，以1.50mg/kg组和3.00mg/kg组为最好效果，但这两组间整体看来并未呈现明显差异性。因此，在实际生产中以1.50mg/kg投喂剂量为最佳。其应用后，鲫鱼血红蛋白、红细胞数、血清凝集抗体效价、SOD活性、吞噬活性和杀菌活性都显著增强。1.50mg/kg的最佳使用剂量的情况下，投喂21d为最佳投喂周期。8．2a—甘露聚糖肽对猪生长性能影响8．2．1实验一动物：“杜长大”三元杂交断奶仔猪添加量：a一甘露聚糖肽在饲粮中添加0.10%(A)和0.15%(B)实验结果：A组和B组与对照组比较：成活率和日增重分别提高了8.34%(P<0.05)和8.34%(P<0.05)、7.69%(P<.005)和9.32%(P<0.01)；料重比和腹泻率分别降低了6.87%(P<0.05)和6.87%(P<0.05)、32.65%(P<0.01)和33.92%(P<0.01)A组和B组结肠菌群和消化机能方面与对照组相比：结肠中双歧杆菌、乳酸杆菌数分别增加了299.49%(P<01)和314.81%(P<0.01),97.40%(P<0.05)和141.67%(P<0.05)；结肠内容物pH值分别降低了0.50(P<0.05)和0.90个单位(p<0.01)；结肠中大肠杆菌以及梭菌数分别下降了86%(P<0.01)和82.47%(P<0.01)以及98.53%(P<0.01)和94.66%(P<0.01)；空肠绒毛高度分别提高了32.20%(P<.001)和29.85%(P<0.01);腺窝深度分别降低了1.682%(P<0.05)和19.20%(P<0.05);十二指肠内容物中总蛋白水解酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性分别提高了 65.05%(P<0.05)和79.84%(P<0.01)、66.00%(P<0.01)和52.24%(P<0.01)、33.06%(P<0.05)和42.34%(P<0.01)；粗蛋白的表观消化率分别提高了6.29%(P<0.05)和5.41%(P<0.05)。所以，a一甘露聚糖肤显著改善了肠道微生态环境和促进肠道发育，增强了十二指肠消化酶的分泌，提高了小肠中蛋白质的消化率。A组和B组免疫力方面与对照组相比：血清中IgG分别提高了23.35%(P<0.01)和25.18%(p<0.01)；IgA分别提高了52.75%(p<0.01)和71.43%(P<.001)；T淋巴细胞转化率分别提高了55.41%(P<0.01)和80.41%(P<0.01)；所以，a一甘露聚糖肤可增强断奶仔猪的体液免疫和细胞免疫功能。8．2．1实验二动物：保育阶段的40日龄小猪含量：a-甘露聚糖肽在饲料中的添加量为0.2%时间：喂养40天以上实验结果：1.1 日增重比对照组提高59.46g(PV0.05);料肉比和发病率分别降低0.1