霍乱等感染性腹泻实验室检测技术的课件

2023/3/31霍乱等感染性腹泻

实验室检测技术东南大学吴健雄实验室2023/3/32感染性腹泻的病原体种类很多，其中肠杆菌科常见致泻菌有致泻性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌，病原性大肠埃希氏菌：肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC)，肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠杆菌（ESIEC）和结肠类耶尔森氏菌。

下面对以上几种常见感染性腹泻的实验室检测技术进行简要介绍。东南大学吴健雄实验室2023/3/33致病性弧菌大肠杆菌志贺氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌空肠弯曲菌致腹泻原虫轮状病毒东南大学吴健雄实验室2023/3/34致泻性弧菌东南大学吴健雄实验室2023/3/35弧菌属种类较多，已定名的有30多种，其中有12个种是人的致病性弧菌或从人的临床标本中分离得到，主要包括：霍乱弧菌、副溶血弧菌、河弧菌、拟态弧菌和麦氏弧菌等。弧菌属中将与O1群霍乱弧菌具有共同鞭毛抗原，生化性状相似，仅菌体抗原不同的弧菌统称为霍乱弧菌。根据菌体抗原不同，将霍乱弧菌分成若干O血清群，目前已有200多个群，其中作为国际检疫传染病，霍乱的病原诊断，仍以检出O1群或O139群霍乱弧菌为准。东南大学吴健雄实验室2023/3/36时间省份流行弧菌分型70年代山东散发地区：非流行株暴发点：小川1b和1d80年代83年以前稻叶1d84年以后小川1b为主,稻叶1d次之90年代90年-92年全国疫情处于低水平93年新疆O139局部暴发94年、98年山东小川1b为主（占99.2%）97年莱阳1株O139群霍乱弧菌2001年烟台、济宁O139群霍乱弧菌至今山东小川1b霍乱弧菌/小川1d，O139历年福建、广州、江苏等小川1b/稻叶1d山东省及其他省份历年霍乱弧菌分型状况东南大学吴健雄实验室2023/3/37O1群和O139群抗原构造与血清分型型别群特异性抗原型特异性抗原AO139BC小川+++少量稻叶+—+彦岛+++O139—+——东南大学吴健雄实验室2023/3/38及时发现传染源和尽快确定疫情，是扑灭霍乱的关键环节，病人的早期发现，首先依靠临床实验室诊断和流行病学指征，从而为有效采取措施提供可靠依据。O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序详见下表。东南大学吴健雄实验室2023/3/39O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序快速诊断增菌培养（碱性胨水）分离培养TCBS、ABS（庆大霉素琼脂等）标本（粪便等）波片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（普通培养）鉴定分型确诊报告第二次增菌（碱性胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接东南大学吴健雄实验室2023/3/310TCBS培养基上弧菌的生长情况菌种TCBS上出现的菌落(%)*评价绿黄霍乱弧菌（O1和O139群）＜199好拟态弧菌1000好梅契尼科夫弧菌0100可能降低霍利斯弧菌1000很差海鱼弧菌95536℃时降低河弧菌0100好弗尼斯弧菌0100好溶藻弧菌0100好付溶血弧菌991好创伤弧菌90#10#好辛辛那提弧菌0100好*产生给予类型菌落的百分数。#Hollis最初报道的蔗糖阳性率为3%，而收到的菌株中，蔗糖阳性率则比较高（15%）。东南大学吴健雄实验室2023/3/311SPA霍乱诊断液使用说明

本诊断液为含A蛋白葡萄球菌菌液经高效价霍乱抗血清致敏后制成，呈均匀混浊白色混悬液。供玻片凝集试验用，可作为急性腹泻病人的快速诊断和人群检索时过筛之用。东南大学吴健雄实验室2023/3/312使用方法：

1、取该诊断液1滴与被检标本等量混合，摇动玻片，3分种内出现明显凝集定为初步阳性，应再做下列步骤。2、取标本约0.5毫升于小试管中，加热煮沸，待冷却后再作一次玻片疑集，如转为阴性者应判该标本为阴性；如仍呈阳性，则判该标本为阳性。3、对阳性标本，同时进行涂片染色，如镜检为弧菌，则报告该试验结果阳性。东南大学吴健雄实验室2023/3/313注意事项：

1、SPA诊断液在使用前，先与质量控制标准液作玻片凝集，如出现凝集，证明可以使用，如未出现凝集，该诊断液不可再用。与阴性对照液（盐水或PBS）不应出现凝集，如凝集时亦不可再用。2、做协同凝集试验所用的标本，应是水样便或经增菌后的培养物，不可用大便直接作凝集，以免影响结果判断。3、本品应放于4℃冰箱保存。用前需先作上述质量检查。东南大学吴健雄实验室2023/3/314假阳性出现多原因：（2%）1、大便内有杂质、非特异性物质的存在。2、操作不当：

a、切勿直接用大便做凝集反应。

b、增菌液中挑取菌膜下层的液体，勿直接挑取菌膜作凝集反应。

c、挑取诊断液与增菌液的比例要适当，挑取的量大一点，少了易干，干后贴在玻片上不易观察结果。三分钟后观察凝集结果，但时间不宜过长。阴性对照要用生理盐水，或直接用诊断液。东南大学吴健雄实验室2023/3/3153、免疫血清没通过其他弧菌吸收，难免有非特异性交叉凝集出现。免疫用菌株经几十年传代发生变异，免疫血清效价降低。4、金黄色葡萄球菌传代多次，发生变异，不易乳化，易出现沉淀，颗粒本身增大。5、观察结果：凝集后液体清、不凝集，对照液液体混浊。

东南大学吴健雄实验室2023/3/316埃尔托型霍乱弧菌噬菌体——生物分型（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所）：为区别埃尔托型霍乱弧菌的两类不同菌株（流行株和非流行株），对各种来源的菌株进行分型，可作为追溯传染来源、传播途径和分析流行形式的流行病学工具之一。详见手册P61-64。

霍乱弧菌与有关细菌的鉴别见手册P54-57。东南大学吴健雄实验室2023/3/317噬菌体分型：根据5株国内分离的弧菌噬菌体（VP1-VP5）将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型。对5株噬菌体全敏感的噬菌体1型菌株是最常见的流行株，但并非所有噬菌体1型菌株均为流行株。2型主要是1型的粗糙型，3-6型也属流行株范畴。7型以后属非流行株，对5株噬菌体全抵抗的是32型。非流行株仅引起散发病例，是一些疫区和非疫区自然水体中的主要菌型。东南大学吴健雄实验室2023/3/318

近年来，O139群霍乱弧菌已成为霍乱流行的主要病原。通过研究证明，O139群霍乱弧菌可能是O1群ELtor生物型的变异株。从以下四点说明0139的特性，见下图。

(1)抗原构造(2)分泌肠毒素(3)耐药性(4)临床特点东南大学吴健雄实验室2023/3/319O139群霍乱弧菌和O1群弧菌特性对比*相关特性O139群弧菌O1群弧菌抗原构造*有荚膜无荚膜分泌肠毒素均产生霍乱肠毒素，产毒量为10-80ng/ml（O139群在抑制状态也可恢复产毒能力）耐药性氯霉素、红霉素、庆大霉素敏感链霉素、磺胺、复方新诺明耐药四环素敏感耐受弧菌抑制剂呈抗性对高、低浓度均呈敏感反应临床特点住院病例85%严重危及生命、出现严重脱水，经补液与四环素治疗病程为2天。（01群免疫力者对0139无免疫力）东南大学吴健雄实验室2023/3/320

O139群霍乱弧菌和O1群弧菌二者生物型既有区别又有联系，最大区别是荚膜和O1群生物合成基因的有无。这些提示说明O139群霍乱弧菌不是O1群ELtor生物型简单的点突变，可能存在更复杂的突变机制。二者是否只有个别基因和表型的差异以及是什麽原因导致了这些差异（尤其是O139群表面荚膜的出现）还有待于进一步的研究。东南大学吴健雄实验室2023/3/321大肠杆菌东南大学吴健雄实验室2023/3/322一、分类

到目前为止,所发现的对人类有致病作用的大肠埃希氏菌已有六个种别，即:

肠道致病性大肠杆菌(EPEC)肠道侵袭性大肠杆菌

(EIEC)

肠毒素性大肠杆菌(ETEC)肠集聚性粘附大肠杆菌

(EAggEC)肠出血性大肠杆菌

(EHEC)肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠杆菌(ESIEC)

东南大学吴健雄实验室2023/3/323二、实验室诊断

1.肠道致病性大肠杆菌(EPEC):

EPEC是最早被认识的腹泻性大肠埃希氏杆菌,其生化特性与一般大肠杆菌相同,

如分解葡萄糖产酸并产气,发酵乳糖和蔗糖,靛基质和甲基红试验室诊断主要靠血清学。到1997年为止,国际上据不完全统计已发现了39个“O”群,但各国常见的“O”群比较局限,主要的O血清型包括O55、O86、O111、O119、O125、O126、O127、O128ab和O142。

东南大学吴健雄实验室2023/3/3242.肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC):

EIEC的生化反应、抗原成份、致病机理均与志贺氏菌有相同之处。除

O124的部分菌株有动力外,其他均为无动力株。另外,EIEC与志贺氏菌抗原之间互相交叉也比较突出。

EIEC的实验室诊断中血清学是很重要的检测手段。目前,国内已有11种/套的诊断血清。我省在近几年的腹泻检测中检出：028ac、O29、O112、O124、O136、O144、O152、Ol64和01679个血清型。东南大学吴健雄实验室2023/3/3253.肠毒素性大肠杆菌(ETEC):

ETEC的生化反应与一般大肠杆菌相同。本菌的特点是产生不耐热的肠毒素(LT)和耐热的肠毒素(ST),有些菌株两种肠毒素均产生,有些菌株只产生其中的一种。最常见的0血清型有：06、O8、O15、O20、O25、O27、O63、O78、O80、O114、O115、O128ac、O148、O153和O167。

ETEC的实验室诊断主要是肠毒素的测定。常用的试验方法有：兔肠结扎试验，Bikerl试验(平板扩散试验)和酶联免疫试验。目前己有诊断血清。

东南大学吴健雄实验室2023/3/3264.肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC):

EAggEC是近几年新发现的一种与人类腹泻有关的大肠杆菌,该菌对Hela的细胞(子宫颈癌细胞)或Hep-2细胞(喉癌细胞)有特殊的积聚性黏附现象,使细菌与细菌之间,细菌与细胞之间呈砖块样堆积状黏附.。目前,EaggEC的诊断主要是细胞试验和特异性DNA探针。

东南大学吴健雄实验室2023/3/3275.肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的鉴定：

O157：H7大肠杆菌属于肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个最常见、最重要的血清型。感染本菌后,主要临床症状为：突发性腹痛,初期有水样便,随即出现血性粪便,低烧或不发烧,严重者可导致溶血性尿毒综合症,血小板减少性紫癫和其它脏器的损伤。因此,快速、准确做出诊断为临床治疗、防止该菌传播提供信息具有特别有重要的意义。

东南大学吴健雄实验室2023/3/328（1）Ol57:H7大肠杆菌的微生物学特性:

该菌符合大肠杆菌的主要特点如:革兰氏阴性杆菌,无芽胞,有鞭毛,能运动。需氧或兼性厌氧,培养温度为37℃,在普通培养基上生长良好。

东南大学吴健雄实验室2023/3/329（2）Ol57：H7大肠杆菌与其他大肠杆菌的主要区别：O157：H7大肠杆菌与其他大肠杆菌明显不同的是不发酵或迟缓发酵山梨醇。

与非出血性大肠杆菌不同的是能产生志贺样毒素(SLT)。0157:H7大肠杆菌与其它大肠杆菌有鉴别意义的生化特性见表-l。东南大学吴健雄实验室2023/3/330表-10157:H7大肠杆菌与其它大肠杆菌有鉴别意义的生化特性东南大学吴健雄实验室2023/3/331自92年以来,我省收集O157:H7大肠杆菌绝大多数菌株均具有丰富的“K”抗原。因此,在作试管凝集时活菌凝集效价很低,而死菌能达到血清原效价。东南大学吴健雄实验室2023/3/3326.肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠杆菌(ESIEC):这是中国预防医学科学院的流行病学微生物学研究所发现的一种新的致泻性大肠杆菌。

其主要特点是:即产生志贺样毒素又对上皮细胞有侵袭力,与肠侵袭性大肠杆菌的

INV探针、志贺样毒素1或志贺样毒素2的探针杂交,它也属于产VT毒素的大肠杆菌。

ESIEC和0157:H7大肠杆菌的共同点都是产生志贺样毒素(VT毒素),不同的地方是0157:H7大肠杆菌的粘附性菌毛具有一定致病作用,而ESIEC具有侵袭力。

东南大学吴健雄实验室2023/3/333

ESJEC的毒力不比O157:H7大肠杆菌差,而且在腹泻病人大便中分离到的大肠杆菌中占的比例非常高.在北京地区占31.4%,我省占4.8%.

ESJEC实验室诊断:首先排除已知的其他感染性大肠杆菌。取待检菌和INV,SLT1或SLT2核酸探针杂交。东南大学吴健雄实验室2023/3/334动物试验结果表明:

ESIEC的毒力和致病力不比

O157H7大肠杆菌差,而且

ESIEC在从腹泻病人大便中分离到的大肠杆菌中(己知的病原性大肠杆菌不包括在内)占的比例非常高,在北京地区点31.4%,在我省占14.8%。

ESIEC对我国人民的危害可能比前面所叙述的病原性大肠杆菌还要大,理应引起高度重视。东南大学吴健雄实验室2023/3/335

ESIEC的实验室诊断:（1）首先排除己知的其他感染性性大肠杆菌。（2）取待检菌和INLSLTl或SLT2核酸探针杂交。东南大学吴健雄实验室2023/3/336志贺氏菌东南大学吴健雄实验室2023/3/337

志贺氏菌是引起人类痢疾的病原体，通常是自限性的,平均持续4-7天。本病的严重程度和病死率与宿主、年龄和得病前的营养状况及细胞血清型别的综合因素相关。感染宋内氏痢疾杆菌,多数病程短,除免疫抑制者外,几乎不致死。福氏痢疾杆菌的某些菌株能遗传易感倾向的人引起反应性关节病(莱特尔综合征)。

东南大学吴健雄实验室2023/3/338从粪便或肛拭中检出痢疾杆菌即可作出细菌学诊断。标本及时送到实验室处理和使用适当的选择性培养基(同时采用一种弱选择性——麦康凯琼脂和一种强选择性——CSLD

或

SS琼脂)常可增加检出痢疾杆菌的机会。注意：分离志贺氏杆菌Ⅰ型时,要特别小心，因为这种细菌在一些选择性培养基包括

SS琼脂上会被抑制，感染病疾时,大便中常会出现脓细胞。东南大学吴健雄实验室2023/3/339病原体志贺菌属四个种或血清群组成:A群：志贺痢疾杆菌

B群：福氏痢疾杆菌

C群：鲍氏痢疾杆菌D群：宋内痢疾杆菌

A,B,C和

D群再分别分为12,13,18和血清型和亚型,它们以阿拉伯数字和小写英文字母来表示(例如福氏病疾杆菌2a)。痢疾杆菌对肠上皮细胞的侵袭力有赖于一种特定毒力质粒。人类的感染剂量很低(志愿者试验显示10-100个细菌即可致病)。

东南大学吴健雄实验室2023/3/340(一)病原学

分类学：

志贺氏菌属是肠杆菌科艾希氏菌族中的一个属,与同族埃希氏菌属非常接近。志贺氏菌属发酵糖、醇类的能力较埃希氏菌属为弱。

东南大学吴健雄实验室2023/3/341

形态学：

本属细菌为需氧或兼性厌氧,营养条件要求不高，能在普通培养基上生长。

pH6.4~7.8，温度10-40℃之间均能生长,最适温度37℃在变通培养基上经37℃培养24小时，菌落光滑圆形、微凸、无色半透明，直径约2毫米在液体培养基中呈均匀混浊生长。东南大学吴健雄实验室2023/3/342生化特性：

本菌属是无动力的革兰氏阴性杆菌,各群志贺氏菌属基本的生物学特性见下表－1：东南大学吴健雄实验室2023/3/343(二)采样1、以新鲜粘液血便为主(亦可采用肛拭子取)。最好在服药前采便,取便后应及时送检验室接种培养，否则应将粪便标本或肛拭子放入带有保存液的管内，或置

Cary-Blair运送培养基内，送检验室培养或放置4-10℃冰箱暂存，在收到送检标本后，应即刻接种培养。

东南大学吴健雄实验室2023/3/3442、如为慢性痢疾患者或带菌者粪便、食品等标本,可先置有保存液或运送培养基内,取标本接种于

GN肉汤/GN肉汤接种物。在室温>25℃时即有增菌作用,在炎热季切,GN肉汤均应冷藏送检,接种量不能超出l:10。增菌时间不能超过6小时。3、其他标本：如水或污水等,按有关规定进行。

东南大学吴健雄实验室2023/3/345(三)检验程序

（见表-2）东南大学吴健雄实验室2023/3/346（四）、检验方法

1、增菌：如系慢性痢疾患者,带菌者的粪便或食品、水等标本含菌量少者，需要接种GN肉汤增菌。

2、分离培养：取病人粪便或肛拭增菌后的培养液,用棉拭或接种环取标本接种于

SS琼脂平板和

EMB琼脂平板,划线分离后置37℃培养18-24小时。

3、纯培养：挑选无色、微凸、半透明、边缘整齐、表面光滑(宋内氏志贺氏菌可能有较混浊的粗糙型菌落),中等大小、不发醇乳糖的疑似菌落3-5个分别接种在克氏双糖培养,37℃培养过夜。

东南大学吴健雄实验室2023/3/347小肠结肠炎耶尔森氏菌东南大学吴健雄实验室2023/3/348

本菌属新近确认的在低温也能繁殖生长的肠道病原菌。山东省在1985-1986年，对引起的腹泻进行调查，证实猪是主要传染源和宿主。并发现牛、鹅、鸟，11种动物带菌。其主要血清型共24个，主要致病性菌株为：O：3血清型生物3型。Sereny试验（侵袭力试验）阳性，与国外报道的O：8型有所不同。小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见下表：东南大学吴健雄实验室2023/3/349轮装病毒较难进行细胞培养，目前主要检测手段仍是用电镜法和ELISA法及核酸电泳法检测粪便中的病毒抗原。ELISA法操作简便、敏感，肉眼可判定结果，适用于大规模样品调查，但易受条件影响，可造成假阳性，实验时应充分注意。阿米巴滋养体直径15-30伪足透明，内质可含