沉淀蛋白质地常用方法

实用标准文案沉蛋质常方（TCA乙、酮淀白作骤2010-08-1815:19TCA-DOCForprecipitationveryproteinconcentration1)Tooneproteinsolution,add1/100vol.2%DOC(Nadeoxycholate,detergent).2)Vortexandletsit30min4oC.3)Add1/10ofTrichloroacetic(TCA)vortexletON4oC(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgMaintaindarkat4oC.Becareful,usegloves!!!).4)Spin15min4oCinmicrofugemaximum(15000g).Carefullydischargesupernatantandthedrytubeinversiontissuepapermaybedifficult[OPTION:Washpellettwicerepellet5minfullbetweenwashes].5)Drysamplesunder(speedordryair.ForSDS,resuspendinaminimalofsamplebuffer.(Thepresenceofsomeayellowcolourasaconsequencetheacidificationofthebuffertitratewith1NNaOHorTrisHClpH8.5toobtainthebluebufferNormalTCAToeliminatesolubleinterferencesandproteinconcentration1)ToasampleproteinsolutionaddTrichloroaceticacid(TCA)100%toget13%finalconcentration.and–20oCandthen15min4oC;longerat4oCthe–steplowerconcentration.Suggestion:leaveONiftheproteinconcentrationisverylow.(preparationof100%454mlTCA.Maintainindarkat4oC.Beusegloves!!!).2)Spin15min4oCinmicrofugemaximum(15000g).Carefullydischargesupernatantandthedrytubeinversiontissue(pelletmaybedifficulttosee).3)SDS,resuspendsamplesinaminimalofbuffer.(TheofsomeTCAcangiveyellowasaconsequenceoftheacidificationthesamplebuffer;titratewith1NorTrisHClpH8.5obtainnormalsamplecolour.)AcetonePrecipitationToeliminateacetonesolubleinterferencesandproteinconcentration精彩文档

实用标准文案1)Addvolumeproteinsolutionto4volumescoldacetone.Mixandat20min–20oC.(Suggestion:leaveiftheconcentrationisvery2)Spin15min4oCinmicrofugemaximum(15000g).Carefullydischargesupernatantandthedrytubeinversiontissue(pelletmaybedifficulttosee).3)Drysamplesunder(speed-vac)drytoeliminateacetone(smellForSDS,resuspendinminimalofsamplebuffer.EthanolPrecipitationUsefultoconcentrateproteinsandremovalGuanidineHydrochlorideSDS1)Addtovolumeproteinsolution9volumescold100%.Mixandkeepleast10min.at–20oC.(Suggestion:leaveON).2)Spin15min4oCinmicrocentrifuge(15000g).Carefullydischargesupernatantandthedrytubeinversiontissue(pelletmaybedifficulttosee).3)pellet90%ethanolat–20oC).andrepelletsamplesatfull4)Drysamplesvaccum(speedvac)ordryairtoeliminateanyethanolresiduetubes).SDS,resuspendsamplesaminimalvolumesampleTCA-DOC/AcetoneUsefulmethodtoconcentrateproteinsandacetoneandTCAinterferences1.volumeofproteinadd2%Nadeoxycholate(DOC)0.02%final100μlsample,1μlDOC).2.Mixandkeepattemperatureatleastmin.3.100%trichloroaceticacid(TCA)toget10%finalconcentration(preparationof100%454mlTCA.Maintainindarkat4oC.Beusegloves!!!).4.Mixandkeepattemperatureatleast1hour.5.Spinatfor10min,removesupernatantandretainpellet.Drytubeinversiontissue6.Add200μloficecoldtoTCApellet.7.Mixandkeeponforleastmin.8.Spinat4oCforminmicrocentrifugeatmaximum9.Removesupernatantbeforedryairpellettoeliminateacetone(smellForSDS,resuspendinminimalofsamplebuffer.精彩文档

实用标准文案10.presencesomecanayellowcolourasconsequenceoftheacidificationofthesample;titratewithNaOH1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)AcidifiedAcetone/MethanolUsefulmethodtoremoveacetonemethanolinterferencesSDSIEF1)Prepareacidifiedacetone:acetone10μlHCl(1mMfinalconcentration).2)Prepareprecipitationreagent:Mixequalvolumesacidifiedandmethanolandat3)Tooneofproteinsolutionadd4volumesprecipitationreagent.andONat-20oC.4)Spin15min4oCinmicrofugemaximum(15000g).Carefullydischargesupernatantandthedrytubeinversiontissue(pelletmaybedifficulttosee).5)Drysamplesunder(speed-vac)drytoeliminateacetonemethanol(smellTCA-EthanolPrecipitationUsefultoconcentrateproteinsandremovalGuanidineHydrochlorideSDS1)Dilute10-25lsamples100lwithH2OAdd100μltrichloroaceticacid(TCA)andmix(preparationTCA:H2O/kgMaintaindarkat4oC.Becareful,usegloves!!!).2)Leaveice20min.at4oCfor15mininmicrocentrifugemaximum3)Carefullydischargesupernatantandretainthedrybyinversionontissuemaybedifficultsee).4)Washpellet100μlice-coldethanol,dryresuspendinbuffer.5)IncasetherearetracesofGuHClpresent,samplesbeimmediatelyboiling7minat6)(ThepresenceofsomeTCAcangiveyellowasaconsequenceoftheacidificationofthesample;titratewithNaOH1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)PAGEProteinandEnrichmentKit-PIERCEThePAGEprep?enablesremovalmanychemicalsthatinterferewith精彩文档

实用标准文案SDSanalysis:guanidine,ammoniumsulfate,commonacidsandbases,detergents,dyes,DNA,RNA,andPIERCE:-prepTMClean-upEnrichment(pdf)ChloroformPrecipitationUsefulforRemovalofsaltdetergents1)Tosampleofstartingvolume1002)Add400ulmethanol3)Vortexwell4)Add100ulchloroform5)Vortex6)Add300ulH2O7)Vortex8)Spin1minute14,00009)Removetoplayerisbetweenlayers)10)Add400ulmethanol11)12)2minutes@14,000g13)asmuchMeOHaspossiblewithoutdisturbing14)Speed-Vactodryness15)up2XsamplebufferPAGEReference:Wessel,D.andFlugge,U.I.Anal.138,141-143哈哈,我做过这个论文哈1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDSPAGE连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL冲系统，浓缩胶是，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动由于导电性与电场强度成反比这一区带便形成了较高的电压剃度压着蛋白质分子聚集到一起浓缩为一狭窄的区带当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后同时由于分离胶孔径的缩小在电场的作用下蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2.样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原理、非还原SDS理、带有烷基化作用的还原SDS理。精彩文档

实用标准文案1还原SDS理：在上样buffer加入SDSDTT或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成蛋白相结合的分子，在电泳中只根据分子量来分离般电泳均按这种方式处理样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min再离心加样。2带有烷基化作用的还原SDS理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团到较窄的谱带碘乙酸胺捕集过量的，而防止银染时的纹理现象。100ul样品冲液中10ul20％碘乙酸胺，并在室温保温30min3非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3.SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL统，与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4.提高SDS泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合可提高凝胶的分辨率建议做法待凝胶在室温凝固后可在室温下放置一段时间使用忌即配即用或冰箱放置前者易导致凝固不充分，后者可导SDS晶。一般凝胶可在室温下保4，SDS水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑考马斯亮蓝银染色三种染料不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6.“眉（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8.为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9.什么是“鬼带，如何处理？鬼带”就是在跑大子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀主要由于还