化学化工分析方法选择

（能源化工行业）化学化工分析方法选择化学化工分析方法选择-研发分析方法开发初探作者:金属元素前言作为一名分析工作者来说,如何把工作做好有关气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)以及化学分析(CA)的资料,书籍有很多很多,有关于分析方法选择的知识也介绍了很多,其中很多内容虽然很详细,但我们在实践中有时总是力不从心,究其原因是对仪器分析,化学分析综合讲述的文章或资料较少,很多都靠经验去累积、去发现。虽说不同的物质有不同性质，不同分析方法，但其中总有很多规律可循。本文对此做了初步研究，提出一种思路,希望能带给很多人带来帮助,尤其是刚入门的分析人员。同时也希望有不同看法的朋友们、老师们多提宝贵意见。您可直接留言或发送看法至邮箱limengdalian@163.com。同行交流可直接与我沟通qq:444548487。我希望交更多的好朋友.共同学习共同进步。第一章研发分析定义、特点、以及对分析人员要求。一般的,我把化学化工研发过程中用于原料、中控和产品的定

性、定量检测或对于已成熟(指已有药典或国标规定的或已经过验证的)的分析方法由于没有所需仪器或试

剂等原因而不得不再寻找新方法的过程称之为研发分析。研发分析特点：1、研发分析没有现成的分析方

法，绝大部分靠分析人员自己摸索有时经过数月也未必找到满意的方法，难度大是其特点之一。2、在现在

市场竞争如此激烈的今天工作速度与效率显的尤为重要，工艺研发已将产品作出，而分析方法尚未找好而

影响了进度，不合理的分析方法甚至影响准确度使工艺研发陷入误区导致发货延期、退货等进而影响企业

竞争力。可见压力大是研发分析另一特点。.3、研发产品及工艺变换频繁,要求分析方法不断变换以适应新

工艺新产品要求不断优化与改变。4、研发分析更注重产品的纯度对工艺的影响。对研发分析人员要求：

准、快、省、简便、安全。即分析数据要可靠,有一定的指导性；分析速度一定要快；从开发方法到分析出

结果要有一定的效率；并节约成本安、简单。这几点就要求分析人员具备非常扎实的基本功,与较为丰富的

分析基础知识和实践操作技能。第二章研发分析方法开发的一般思路1,常规分析中我们接触最频繁应最为

广泛的即气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)以及化学分析(CA)同时很多方法也非常成熟为大家所认可很

多成为药典或国标中的方法,并且很多分析室都具备常规化学分析所用试剂,器皿以及气相色谱仪、液相色

谱仪等。1但是针对于价格较为昂贵的仪器以及其分析室配备就为许多小型或投入较少的分析室所望而却步了，比如

说原子吸收、核磁共振、红外光谱仪、气（液）质联用等，莫说如此就光气相色谱及液相色谱的各种检测

器，其昂贵的价格就令我们只得甘心仅拥有最常用的FID(GC用)、UV(HPLC用)。其实这并不要紧硬件不足，我们完全可以依靠我们的经验及技术尽力弥补。下面详细说一下分析方法的开发思路。21、综合分析物质的物料物性。分析一化学物质纯度，就必须借助文献、化工词典等尽可能多的掌握其物料物性，其中可能存在的有机物或无机物甚至其一般的化学合成工艺以及化工用途，这些都会对你的分析用很多帮助。试想一下我们连其基本资料都没搞清楚还说分析数据可靠，那真是不可思议了。2、然后根据以上资料综合考虑是采用气相色谱(GC)还是高效液相色谱(HPLC)亦或化学分析(CA)，就选择哪种分析方式上要考虑是否适合同时兼顾准确度，速度，成本，安全，简便等因素。当然有些物质三种方法都可分析那就必须考虑采用那种方法更合适。3、方法的验证。下面举例说明开发方法思路，由于一些研发工艺的保密性我们只举例些常用的化工原料来说明：如特戊酸含量的分析：一、查明物料物性。中文名称:三甲基乙酸别名：三甲基醋酸，新戊酸，2.2-二甲基丙酸英文名：Pivalicacid;Trimethylaceticacid;2,2-Dimethylpropanoicacid;Neopentanoicacid分子式:C5H10O2分子量:102.13CAS编号：75-98-9分子结构：外观(纯品)：无色、无味液体（或无色结晶）沸点(常压下):163-164℃熔点:33-35℃相对密度：（20/4℃）0.905折射率：1.393性质描述:特戊酸有一定的腐蚀性，微溶水，易溶于醚、醇。易溶于乙醇、乙醚，溶于水。生产方法:1.异丁醇和甲酸在浓硫酸作用下反应得叔戊酸。2.将硫酸加入高压釜，用一氧化碳置换釜中空气，然后充入一氧化碳使压力达5MPa左右。用计量泵加入异丁烯与三氯甲烷的混合液。在5MPa左右，室温下搅拌半小时，泄压后将物料倾出至冰水中，在5-15℃搅拌15min。分取三氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥、蒸馏，收集65-70℃（2.67kPa）馏分，得纯度为97%的三甲基乙酸。收率74%。3.叔丁醇与甲酸（98%）在浓硫酸存在下反应制得。用途:用于生产烯烃聚合引发剂TBPP的原料，也用于生产聚氯乙烯的稳定剂和香料的原料等。戊酸为农药、医药、染料中间体，用于高档涂料聚合引发剂、感光材料、香料、润滑油等。二、分步分析方法选择与比较。在此我们首先了解气相色谱(GC)与高效液相色谱(HPLC)的区别与联系。相同点：二者都针对有机分析，互为补充，相得益彰并且基本概念及理论基础（如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等）是一致的。不同点：1、适用物质不尽相同。气相色谱适用于小分子、易气化（沸点低）、热稳定性好的有机物而高效液相色谱适用分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物。2、流动相的不同。气相色谱以气体为流动相（如N2、H2、He等）而高效液相色谱以液体为流动相（正相以正己烷、四氢呋喃、氯仿等反相以水、乙腈、甲醇等）。3、流动相传输动力不同。气相色谱以高压钢瓶盛装以高压直接推动气体流动而高效液相色谱以高压泵推动液体流动。4、色谱柱不同。气相色谱柱无论是填充柱还是毛细管柱常用的一般至少长15m，而高效液相色谱柱常用的一般最长不超30cm。但高效液相色谱柱柱效确远高于气相色谱柱。气相色谱柱无路是极性还是非极性的一般耐高温（极性柱可耐高温达250-280℃而非极性柱更是耐高温达300-320℃）而高效液相色谱柱一般只能在50℃以下使用。5、分离原理不同。气相色谱主要依靠物质沸点不同进行分离，只有两种物质沸点较为接近时，才通过改变色谱柱极性来达到分离目的即物质的极性不同是气相色谱得以分离的次要原因。而高效液相色谱只依靠物质的极性不同来实现分离目的的。6、检测器不同。气相色谱根据检测原理的不同，检测器可分为浓度型检测器（concentrationsensitivedetector）和质量型检测器（massflowratesensitivedetector）。浓度型检测器的电信号大小与组分的浓度成正比，如热导池检测器和电子捕获检测器等。质量型检测器的电信号大小与单位时间内进入检测器的某组分的质量成正比，如氢火焰离子化检测器和火焰光度检测器等。1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。我们再来了解一下仪器分析(主要指气相色谱和高效液相色谱)与化学分析的区别与联系。很多仪器分析要借助化学分析的一些处理手段来处理样品，而化学分析很多操作有被仪器分析所取代。分析化学是研究物质的组成、状态和结构的科学，它包括化学分析和仪器分析两大部分。二者的区别主要有：一、分析的方法不同：化学分析是指利用化学反应和它的计量关系来确定被测物质的组成和含量的一类分析方法。测定时需使用化学试剂、天平和一些玻璃器皿。而仪器分析（近代分析法或物理分析法）：是基于与物质的物理或物理化学性质而建立起来的分析方法。这类方法通常是测量光、电、磁、声、热等物理量而得到分析结果，而测量这些物理量，一般要使用比较复杂或特殊的仪器设备，故称为“仪器分析”。仪器分析除了可用于定性和定量分析外，还可用于结构、价态、状态分析，微区和薄层分析，微量及超痕量分析等，是分析化学发展的方向。二、仪器分析与化学分析的特点不同：1.仪器分析适合于微量、痕量和超痕量成分的测定。㆔g、㆔灵敏度高，检出限量可降低。如样品用量由化学分析的mL、mg级降低到仪器分析的L级，甚至更低。而化学分析适合常量分析。2.仪器分析选择性好。很多的仪器分析方法可以通过选择或调整测定的条件，使共存的组分测定时，相互间不产生干扰。化学分析干扰较大，一般通过掩蔽等方法加以消除。3.仪器分析操作简便，分析速度快，容易实现自动化。而化学分析多为手工操作相对麻烦。4.仪器分析相对误差较大。化学分析一般可用于常量和高含量成分分析，准确度较高，误差小于千分之几。多数仪器分析相对误差较大，一般为5%，不适用于常量和高含量成分分析。5.仪器分析仪器分析需要价格比较昂贵的专用仪器。而化学分析成本较低一般小型分析室都能开展。三、仪器分析与分析化学的关系：二者之间并不是孤立的，区别也不是绝对的严格的。a.仪器分析方法是在化学分析的基础上发展起来的。许多仪器分析方法中的式样处理涉及到化学分析方法（试样的处理、分离及干扰的掩蔽等）；同时仪器分析方法大多都是相对的分析方法，要用标准溶液来校对，而标准溶液大多需要用化学分析方法来标定等。b.随着科学技术的发展，化学分析方法也逐步实现仪器化和自动化以及使用复杂的仪器设备。化学方法和仪器方法是相辅相成的。在使用时应根据具体情况，取长补短，互相配合。四、学习掌握的目标不同：化学分析主要的内容为：数据处理与误差分析、四大滴定分析法、重量分析法。学习化学分析要求掌握其基本的原理和测定方法，建立起严格的“量”的概念。能够运用化学平衡的理论和知识，处理和解决各种滴定分析法的基本问题，包括滴定曲线、滴定误差、滴定突跃和滴定终点的判断，掌握重量分析法分析化学中的数据处理与误差处理。正确掌握有关的科学实验技能，具备必要的分析问题和解决问题的能力。仪器分析涉及的分析方法是根据物质的光、电、声、磁、热等物理和化学特性对物质的组成、结构、信息进行表征和测量，学习仪器分析要求掌握的现代分析技术，牢固掌握各类仪器分析方法的基本原理以及仪器的各重要组成部分，对各仪器分析方法的应用对象及分析过程要有基本的了解。可以根据样品性质、分析对象选择最为合适的分析仪器及分析方法。仪器分析法是以物质的物理性质或化学性质为基础的分析方法。因为这类分析方法需要专用的仪器，故称为仪器分析法。最重要的一类是利用物质的光学性质进行测定的，称为光学分析法。另一类是利用溶液的电化学性质的分析方法如电重量分析法、电滴定分析法等。仪器分析法的优点是快速、灵敏度高，操作比较简单，但一般不适用于常量组分的测定。化学分析法是以物质的化学反应为基础的分析方法，主要有重量分析法和滴定分析法等。现在我们知道了气相色谱、高效液相色谱和化学分析的区别与联系后就可以进行方法的选择与开发了。鉴于我们考虑兼顾准确度，速度，成本，安全，简便等因素我们选择方法的思路是能进行气相色谱分析的不进行高效液相色谱分析能进行仪器分析的不进行化学分析。所以特戊酸分析首先考虑气相色谱分析。从特戊酸先前所查的资料和气相色谱分析要求可知进行气相色谱分析是完全可能的。第二章气相色谱分析方法选择下面就气相色谱分析条件的选择作一介绍。载气的选择：要了解各种载气性质以及与检测器的匹配情况。在热导池体温度与载气流速等实验条件恒定时，检测器的灵敏度决定于载气与组分热导率之差，两者相差越大，电阻R改变越大，检测器越灵敏。若λ＝λ，则不产生信号。现将几种物质的热导率列上表7-2。由表可看出，若用氮气为载气，样品为空气。因为λ＝λ，则样品不出峰。氮气的热导率比较小，与多数有机物的热导率[一般小于3×10W／(m·K)]相差较小，因此用氮气为载气时，灵敏度低，且有时出倒峰。若选用氢气为载气，可获得较高的检测灵敏度，而且不出倒峰，但不安全，并且有一定的还原性做有些物质时要特别的注意。氦气惰性较好各方面比较都很理想，但价格较贵现国内很难买到。综合来说在小型实验室来说氮气为载气还是不错的选择，如果要求苛刻、不计成本那必选氦气。如做痕量分析并所做物质性质稳定的话选氢气较为理想。载气的流速选择：由速率方程式H=A+Bu+Cu可知，流速对柱效的影响很大，因踏板高度H与分子扩散项中的流速成反比，而与传质阻力项中的流速成正比，故必定有一个最佳流速，能使H达到最小，柱效最高。以不同流速下测得的塔板高度H为纵坐标，流速u为横坐标作图，可得H－u关系曲线，如图21-5所示。在曲线的最低点，塔板高度H最小图21-5H－u关系曲线（H最小u最佳为了缩短分析时间，通常控制的流速稍高于最佳流速。根据速率理论和速率方程可以选择不同的载气，以便提高柱效。比如，当载气流速较大时，传质阻力项对柱效能的影响是主要的，应选使C值变小的载气。相对分子质量小的载气，如H2、He等，因为组分在载气中有较大的扩散系数，减小传质阻力，有利于提高柱效；当载气流速较小时，分子扩散项对柱效能的影响是主要的，应选择使B值变小的载气。相对分子质量较大的载气，如N2、Ar等，因使组分在载气中有较小的扩散系数（见21.2.2气化温度的选择：气化温度的选择应以保证试样能迅速气化且不分解为准。适当提高气化温度对分离及定量都有利。一般选择的气化温度比柱温高20℃㆔70℃。柱温的选择柱温是一个非常重要的操作变量，直接影响分离效能和分离速度。首先要考虑每种固定液都有一定的使用温度。柱温不能高于固定液的最高使用温度，以免固定液挥发流失。柱温对组分分离的影响较大，提高柱温使各组分的挥发程度接近，不利于分离，所以，从分离的角度考虑，宜采用较低的柱温。但柱温太低，会使组分在两项中的传质速率大为降低，峰形变宽，柱效能下降，分析时间延长。因此，选择柱温的原则是保证使难分离的组分能达到较好分离效果的前提下，选择尽可能低的柱温，但以保留时间适宜，峰形正常为限。通常归一化方法选择程序升温较好，而内外标选择恒温就可以。进样时间和进样量选择：进样速度应尽可能快，否则会因试样原始宽度的变大，而造成色谱峰的扩张，甚至使峰变形。一般当用注射器或气体进样阀进样时，要求在一秒钟内完成进样。进样量应保持在使峰面积或峰高与进样量成正比的范围内。检测器性能不同，允许的进样量也不同。液体试样一般进样0.1㆔1μL，气体试样一般进样0.1㆔10mL。色谱柱选择：增加柱长可提高分离效果。但柱长过长，使分析时间延长。所以在满足一定分离度的条件下，应选用尽可能短的色谱柱。填充柱的柱内径一般为3㆔6mm，毛细管柱的内径0.1㆔0.5mm。固定液的用量选择：担体的表面积较大时，固定液用量可多些，允许的进样量也相应增加。但从速率方程式的传质项中可知，为了减小液相的传质阻力，应使固定液的液膜厚度尽可能薄。但固定液液膜太薄，则允许的进样量也就越少。因此固定液的用量要根据具体情况决定。固定液的配比选择：（指固定液与担体的质量比）一般为5㆔100到25㆔100。担体的比表面积越大，固定液用量的比例可越高。担体的性质和粒度选择：若担体的比表面积大，孔径分布均匀，则固定液易分布均匀，从而可加快传质过程，提高柱效。故应该选用颗粒小且均匀的担体，并尽可能填充均匀，以减少涡流扩散，提高柱效。但粒度过小，填充不易均匀，会使柱压降增大，对操作不利。一般对4㆔6mm的柱管，选用60㆔80目或80㆔100目的担体较为合适。常用色谱柱为SE-30、OV-1、OV-101二甲基硅氧烷非极性DB-l、HP-1、CP-Sil5CB、SPB-1、007-1、Rtx-1、BP-1......烃类、胺类、酚类、农药、PCBs、挥发油、硫化物等SE-54、SE-525％苯基，1％乙烯基甲基硅氧烷非极性DB-5、HP-5、CPSil8CB、SPB-5、、Rtx-5、BP-5......药物、芳烃类、酚、酯、生物碱、卤代烃OV-17017％氰甲基，7％苯基甲基硅氧烷中等极性DB-1701、HP-1701、BP-10、CPSil19CB、Rtx-1701、SPB-1701......药物、农药、除草剂、TMS、糖OV-1750％苯基甲基硅氧烷中等极DB-17、HP-50、SP2250、CP-Sil19、Rtx-50、SPB-50......药物、农药、甾类等PEG-20M聚乙二醇20M极性DB-WAX、HP-Wax、CarbowaxSUPELCOWAX10、CPWAX52CB......醇类、酯、醛类、溶剂、单芳、精油等FFAP聚乙二醇20M对苯二甲酸的反应产物极性DB-FFAPHP-FFAPNuk01、SP-1000......醇、酸、酯、醛、腈XE-60、25％氰乙基甲基硅氧烷中极性酯、硝基化合物OV-22525％氰乙基，25％苯基甲基硅氧烷中极性DB，225、HP-225、SP-2330、SPB-225、CP-SIL43CB脂肪酸酯、PUFA、Aldito]OV-21050％三氟丙基硅氧烷极性DB210、Rtx200......极性化合物、有机氯化合物OV-27550％三氟丙基硅氧烷强极性DB210、SP2401、Rtx200......极性化合物、一、固定液非极性：SE30*，OV101，SE54*中极性：OV17，XE60*，OV1701*极性：PEG20M*，FFAP*，DEGS*二、柱内经（mm）0.2~0.25柱效高、负荷量低、流失小0.3~0.35负荷量大于毛细口径柱60%，柱效低0.53~0.6大口径毛细柱，负荷量近似填充柱，总柱效远远超过填充柱，分析速度快三、柱长（m）短柱10~15米分离少于10个组份的样品中长柱20~30米分离10~15个组份的样品长柱50米以上分离50个组份以上的样品四、液膜厚度（μm）薄液膜0.1~0.2μm低负荷量、高沸点化合物标准液膜0.25~0.33μm一般标准毛细柱分析厚液膜0.5~1μm符合量较大，低沸点样品特厚液膜1~5μm取代填充柱，分析沸点200℃以下复杂样品气相色谱检测器选择：热导池检测器（TCD）热导池检测器（thermalconductivitydetector）因其结构简单，灵敏度适宜，稳定性好，而且几乎所有物质都有响应，因此是应用最广、最成熟的检测器之一。氢火焰离子化检测器（flameionizationdetecter）属于质量型检测器。它对大多数含碳有机化合物有很高的检测灵敏度，比热导池检测器的灵敏度高几个数量级，能检测至10㆔12g数量级的痕量有机物。同时因其结构简单，响应快，稳定性好，故它也是一种比较理想的检测器。（鉴于现在氢火焰离子化检测器应用较多这里介绍一下其结构和作用原理，氢火焰离子化检测器的主要部分是离子室。离子室由气体入口、火焰喷嘴、一对电图21-8氢火焰离子化检测器离子室示意图极和不锈钢外罩等组成，如图21-8所示。流出色谱柱的被测组分与载气在气体入口处与氢气混合后一同经毛细管喷入离子室，氢气在空气的助燃下，经引燃后燃烧，在燃烧所产生的高温火焰（约2100℃）下，被测有机物组分电离成正负离子。因为在氢火焰附近150~300V的极化电压，形成直流电场，所以产生的正负离子在收集极和极化极的电场作用下，做定向运动形成电流。此电流大小与进入离子室的被测组分的含量之间存在定量关系。但一般在氢火焰中，物质的电离效率很低，大约每50万个碳原子中，只有一个碳原子被电离，因此产生的电流很微弱，需经放大器放大后，才能在记录仪上得出色谱峰。氢火焰离子化检测器对大多数的有机化合物有很高的灵敏度，故对痕量有机物的分析非常适宜。但对在氢火焰中不电离的无机化合物，如CO、CO2、H2S（2）氢气流量选择：氢气流量的大小将直接影响氢火焰的温度及火焰中的电离过程。若氢气流量太小，火焰温度太低，则被测组分分子电离的数太少，产生的电流信号小，检测灵敏度低，且易熄火。但若氢气流量太大，会使噪声变大，故必须控制氢气的流量。当用N2作载气时，一般控制H2和N2的流量比为1:1~1:1.5。在最佳氢氮比时，检测器不仅灵敏度高，而且稳定性好。（3）空气流量选择：空气是助燃气体，并为组分电离成正离子提供氧气。空气流量在一定范围内，对响应值有影响。当空气流量较小时，灵敏度也较低。但当空气流量达到某一值后，对响应值几乎不产生影响。一般氢气与空气的流量比为1:10。（4）极化电压选择：在氢火焰中电离产生的离子，只有在电场的作用下，才能向两极定向移动产生电流，而且极化电压与检测器的响应值有关。当增加极化电压时，开始阶段响应值增加，而后会趋向一个稳定值。此后继续增加极化电压，检测器的响应值几乎不变。一般选择极化电压为100~300V之间。（5）检测器温度选择：氢火焰离子化检测器的使用温度应控制在80~200℃的范围内。在此温度范围内，灵敏度几乎相同。但在80℃以下时，灵敏度显著下降，一般选择较高温度（280-300℃）。气相色谱定量方法选择：1.归一化法归一化法适用于试样中所有组分全部流出色谱柱，并在色谱图上出现所有组分色谱峰的情况。假设试样中有ｎ个组分，各组分的质量分别为m1，m2，…，mn，各组分含量的总和为m，则试样中任一组分i的质量分数wi可用归一化法（normalizationmethed）公式计算如下wimm=´100%=´100%iimm+m+m12nAf¢=´100%iiAfAfAf¢1122nn2.内标法当只需测定试样中某几个组分的含量或试样中的组分不能全部出峰时，可采用内标法（internalstandardmethed测得色谱图。根据内标物和试样的质量及相应的峰面积来计算被测组分的含量。设被测组分i的质量为mi，称取的试样质量为m，试样中加入的内标物质量为ms，则mA=¢=mfA，iiisss¢Af两式相除整理后可得m=iimisAf¢ss被测组分i的质量分数wi为wimAf¢m=´100%=×´100%iiismAfm¢ss此法可认为是简化的内标法。如果称量同样量m的试样，加入固定量ms的内标物，则式（21㆔25）中mmsf100%i项为一常数，即wiA=iAs·常数（21㆔27）可见，被测组分的质量分数wi与Ai/As成正比。若wi对Ai/As作图可得一条直线，如图21-9所示。根据此直线关系，采用标准曲线法定量十分方便。制作标准曲线时，先将欲测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液。取一定量的标准溶液和内标物，混合后进样分析，测得Ai和As，以Ai/As对标准溶液浓度作图，可得到标准曲线。分析样品时，取试样和内标物的量应与绘制标准曲线时所用的量相同，测出图21-9内标标准曲线试样中被测组分与内标物的峰面积比Ai/As，再从标准曲线上查出被测组分的浓度。此法不必测出校正因子，消除了某些操作条件的影响，也不需要严格定量进样，适合于液体试样的分析。另外，此法与内标法相比可减少称量样品和计算数据的麻烦，适用于工厂质量控制分析。4.外标法外标法(externalstandardmethed)是用欲测组分的纯物质来制作标准曲线的方法。具体方法是取被测组分的纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液，分别取一定量进行色谱分析，得出相应的色谱峰。绘制峰面积（或峰高）对相应浓度的标准曲线。然后在同样操作条件下，分析同样量的未知试样，从色谱图上测当试样中被测组分浓度变化不大时，可不必作标准曲线，而用单点校正法测定，即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，分别分析相同量的试样和标准溶液，由被测组分和标准溶液的峰面积比（或峰高wAi㆔iwAss，Aw㆔iwisAs由于ws与As均为已知，故可令ki=ws/As，则可得wi=ki·Ai式中ki为组分i的单位峰面积质量分数的校正值。只要测得Ai值，利用ki值，由上式即可求出被测组分的质量分数。外标法操作方便，计算简单，但对操作条件的稳定性和进样量的重现性要求比较高，否则会影响结果的准确性。进样针的选择：30100多元吧）如果你的实验室，是GMP管理模式的，或者对分析室成本控制不是很苛刻，那就首选进口针吧。耐用，定量准确。1、根据上面资料分析特戊酸性质比较稳定,(GC)分析。我们选择以下条件：1.方法提要本方法适用于特戊酸含量的测定。2.仪器设备：仪器：GC-Agilent7890色谱柱：HP-1（30m×0.32mm×0.5μm）检测器：FID3.测试条件：柱温：80℃（1min）12℃/min-280℃(5min)汽化室：280℃检测室：300℃载气：N2流速：1.5ML/MIN分流比：1：20燃烧气：H2助燃气：空气300ml/min尾吹气：30ml/min运行时间：20min4.样品制备：直接进样0.6ul。5.定量方法：面积归一化。由谱图我们可以得到以下信息：如果样品中含有大分子羧酸，由于沸点很高，则很难出峰。克服这个缺点可以选择做高效液相色谱(HPLC)。第三章液相方法选择那就象气相色谱分析一样首先对色谱分析条件的选择作一介绍。1、流动相的选择：反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但我推荐你采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：C乙腈＝0.32C2甲醇＋0.57C甲醇C四氢呋喃＝0.66C甲醇C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的6~7倍。由于硅胶表面的硅轻基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如:正己烷(Hexane)、氯仿(Choroform)、二氯甲烷(MethyleneCloride)等。正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团胺基团，如(NH2，APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅轻基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。2、流动相ph的选择：大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围,一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解.采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。3、波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。要了解紫外吸收光谱原理了紫外—可见吸收光谱基础知识①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。生色团：最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。助色团：有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。有机化合物的紫外—可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果：σ电子、π电子、n电子。所需能量最大；σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；σ→σ＊跃迁饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；吸收波长λ<200nm；例：甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为135nm。只能被真空紫外分光光度计检测到；作为溶剂使用；n→σ＊跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。π→π＊跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。（1）不饱和烃π→π*跃迁乙烯π→π*跃迁的λmax为162nm，εmax为:1×104L·mol-1·cm－1。K带——共轭非封闭体系的p→p*跃迁2CH3)))))

共轭烯烃中的p→p*共轭烯烃（不多于四个双键）pp*跃迁吸收峰位置可由伍德沃德——菲泽规则估算。lmax=l基+Snilil基-----是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；无环、非稠环二烯母体：lmax=217nm羰基化合物共轭烯烃中的p→p*①Y=H,Rn→s*180-190nmp→p*150-160nmn→p*275-295nm②Y=-NH2,-OH,-OR等助色基团K带红移，R带兰移；R带lmax=205nm；e=10-100③-b,a不饱和醛酮K带红移：165®250nmR带兰移：290®310nm芳香烃及其杂环化合物苯：E1带180~184nm；e=47000E2带200~204nme=7000苯环上三个共扼双键的p→p*跃迁特征吸收带；B带230-270nme=200p→p*与苯环振动引起；含取代基时，B带简化，红移。羰基双键与苯环共扼：K带强；苯的E2带与K带合并，红移；取代基使B带简化；氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱,㆔max（nm）,㆔max苯,254,200甲苯,261,300间二甲苯,263,3001，3，5-甲苯,266,305六甲苯,272,300有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应立体结构和互变结构的影响。溶剂的影响非极性→极性n→p*跃迁：兰移；¯l；­ep→p*跃迁：红移；­l；¯e4、检测器选择：（1）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。（2）示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；（2）荧光检测器（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；5、HPLC色谱柱选择：常用色谱柱有：PinnacleⅡC18同KromasilC18羰基，脂肪酸，甘油酯，脂溶性维生素，酞酸盐，类固醇PinnacleⅡC8同KromasilC8与C18柱相似，但对憎水成分时间比C18短PinnacleⅡCyano反相和正相柱。比正相硅胶柱稳定。分析炸药，类固醇PinnacleⅡPhenyl聚和芳香烃，聚合芳香族脂肪酸PinnacleⅡAmino单、双糖类成分，配以等度分析和视差折光检测器PinnacleⅡSilica正相分离，中等比表面AllureC18对增水性和弱极性保留值最强，分析炸药和类固醇AllureBasix药物和其它含胺集团成分分析AllureAcidix酸性药物，非衍生氨基酸，烃基，磺酸基，含磷物分离AllureSilica极性正相保留值高，比表面积大，B型硅胶填料UltraC18羰基，脂肪酸，苯胺，巴比妥，脂溶性维生素，酞酸盐，类固醇，PTH氨基酸UltraaqueousC18反相极性保留值高，适应90％以上水性流动相UltraIBD极性和非极性混合样品分析专用柱UltraC8高纯，碱性钝化反相柱，应用广泛，LC/MSUltraC4缩氨酸和小蛋白分析，柱稳定UltraC1可代替UltraODS或辛烷柱极性物质分析UltraCyano碱性药物，类固醇和其它碱性物质分析UltraPhenyl聚合芳烃，烃，嘌呤，嘧啶，极性芳烃，脂肪酸UltraAmino单、二糖等糖类，酯类、苯胺、杀虫剂。弱阳离子交换剂UltraPFP有机卤素化合物功能团的分类先导分析UltraSilica正相分离，高比表面B型硅胶KromasilC4同PinnacleⅡC4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于正己烷,,,用硅胶的正相模式#1,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于有机溶剂,,,熔于甲醇和甲醇：水或乙腈和乙腈：水,,,用键合相的正相模式#2,,,,,,,,,,,,,,分子量〈2000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用键合相的反相模式#3,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于四氢呋喃,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,凝胶渗透（小分子）#4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于水,,,非离子型,,,用键合相的反相模式#5样品,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用离子化控制的键合相的反相模式#6,,,,,,,,,离子型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用离子对试剂的键合相的反相模式#7,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用硅胶的正相模式#8,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,离子交换模式#9,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于有机溶剂,,,,,,凝胶渗透色谱#10,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,分子量〉2000,,,,,,,,,凝胶过滤色谱#11,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶于水,,,,,,用大孔填料的离子交换模式#12,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用大孔填料的反相模式#13,,,,,,,,,,,,下面简单介绍几种常用色谱柱的资料以供参考正相、反相和极性胶联柱使用手册（ChrompackHPLCNormal-,ReversedphaseandPolarbondedcolumns）注意：此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。未正确地使用不能享受保修待遇。简介：此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件1．色谱柱老化：在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。A．在反相条件下老化：要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。B．在正相条件下老化：柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。C．对于极性键合柱的特殊说明：由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。2．洗脱液：一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。3．流量和压力柱内径（毫米）,流速,（ml/min）,最佳,最高2.0,0.2,1.03.0,0.4,2.04.6,1.0,4.010.0,4.7,18.0注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。4．样品准备保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。5．保护柱一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep柱我们建议使用正确型号的ChromSep保护柱。这个柱子的填充材料与用于分析的色谱柱的材料相似。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用相同型号的ChromguardHighEfficiency（高效）柱(10X3.0mm)或HighCapacity（高容量）柱(50X3.0mm)。6．进样量和浓度柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型。很难给出一个一般的指示。对于进样注射了太大体积或太浓的样品会使峰展宽或者峰融合。柱尺寸长度*内径,最大样品体积250×2.0mm,±10μl200×3.0mm,±15μl250×4.6mm,±50μl250×10.0mm,±250μl7．温度HPLC柱最好在柱温箱中使用。重复性取决于温度控制。最佳的温度与特定的应用有关。温度影响洗脱液流动的线速度。在使用ChromSep玻璃柱的时候，一定要调节流速使压力保持在3000psi以下。8．贮存一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。贮存溶剂应当含有至少20%的有机溶剂，以防止有细菌的生长。9．柱效损失的可能原因1．额外的峰展宽。当使用小直径或者长度较短的柱子时，峰展宽的情况可能比较明显。要保证管路的长度和内径都保持最小。检查进样体积和检测器检查池体积是否适用于柱体积。2．洗脱的平衡时间不够。3．不正确柱温。4．不正确的修正浓度。5．床压缩。使用了过大的洗脱流速。将柱子反向，使用低流速。10.柱效丧失和/或高背压1．的流动来冲洗柱子。如果这样不能解决问题，更换进口过滤器或者筛板。2．微生物在洗脱液中生长。倒转柱子，尝试以反向的流动来将污染物冲洗出柱子。更换进口过滤器或者筛板。3．有蛋白质脂肪，油脂污染或者极性化合物等污染。再生柱子（见第1211.再生1．再生反相色谱柱首先倒转柱子。以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照水—甲醇—异丙醇—二氯甲烷—异丙醇—甲醇—水进行。柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。注意：在使用另外的淋洗方法的时候，一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液，保证其后的洗脱液可以混溶。2．再生硅胶柱：首先倒转柱子。以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照异辛烷（或己烷）—乙酸乙酯—干燥的异辛烷（或己烷）进行。柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。3.再生极性键合柱：取决于使用的条件，可以使用反相的条件，也可以使用硅胶柱的条件。注意：绝对不要使用酮类或醛类冲洗氨基柱，因为可能与固定相发生反应。四氢呋喃作为替代可以使用。阴离子交换柱使用手册（ChrompackHPLCIonoSpherAColumns）注意：ChrompackIonoSpherA色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。简介：ChrompackIonoSpherA柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。1.色谱柱老化在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。2.洗脱液推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。3.流量和压力柱内径（毫米）,流速,（ml/min）,最佳,最高2.0,0.2,1.03.0,0.4,2.04.6,1.0,4.010.0,4.7,18.0注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。4、样品准备：保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。5、保护柱一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep柱我们建议使用ChromSepAnion交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用ChromguardAnionexchangeHighEfficiency（高效）柱(10X3.0mm)或HighCapacity（高容量）柱(50X3.0mm)。6、进样量和浓度柱尺寸长度*内径,最大样品体积250×2.0mm,±10μl200×3.0mm,±15μl250×4.6mm,±50μl250×10.0mm,±250μl当样品的洗提强度比洗脱液低（在柱样品预浓缩）的时候，更高的样品量也可以注射。7、温度：ChrompackIonoSpherA柱可以在室温环境使用。为了提高柱子的稳定性，建议不要在40°C以上使用。8、贮存：在贮存柱子以前，建议先用去离子水，然后用甲醇冲洗。一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。9、检测灵敏度：对于使用邻苯二甲酸缓冲液作为洗脱液的阴离子的检测，以下几种方法可用：·折光检测·电导检测·紫外检测邻苯二甲酸缓冲液对所有三种检测方法都是特别好的，因为邻苯二甲酸缓冲液具有高的折光性，相对低的电导率和紫外吸收性质。检测波长取决于要检测的离子。10．系统峰：当你使用ChrompackIonoSpherA柱的时候，系统峰可能会出现。通常一个馏分既溶剂在前面，第二个馏分应当是硫酸盐。方向（正峰或负峰）取决于样品的pH。位置取决于流动相的Ph。较低pH会使系统峰向前移动。在我们的实验中pH值在3.8-4.3之间最佳。11．柱效损失的可能原因额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。洗脱的平衡时间不够。不正确的洗脱液pH或洗脱液的离子强度。洗脱液中存在不正确离子。固定相污染。a.高柱压伴随分辨率降低。1．颗粒物积聚在烧结物或者填充物床上。（a）样品来源---过滤或离心（b）洗脱液来源---过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。（c）系统来源---冲洗整个系统管路和泵；安装在线系统过滤器。2．蛋白质类物质的积聚（a）微生物在样品中生长。3．微生物在洗脱液中生长。b.正常柱压伴随柱效降低1．有机污染（a）样品中有脂肪，油脂，脂质。固定相的表面被覆盖。（b）从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备的洗脱液。（c）在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物，例如在运输时从大气中带来。12.对于纠正污染问题的可能有效的操作3．准备新鲜的洗脱液在很多情况下，柱效的丧失可以归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前准备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤，在使用以前要脱气。4．色谱柱再生要进行色谱柱的再生工作a．首先使色谱柱反向b．以0.4ml/min的流速用1M硝酸铵洗脱30ml。c．以0.4ml/min的流速用40：60（v：v）的甲醇/水洗脱30ml。d．以0.4ml/min的流速用异丙醇洗脱30ml。e．以0.4ml/min的流速用水洗脱30ml。f．以0.4ml/min的流速用洗脱液洗脱30ml。g．将柱子转回正常方向。阳离子交换柱使用手册（ChrompackHPLCIonoSpherCColumns）注意：ChrompackIonoSpherC色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。简介：ChrompackIonoSpherC柱填充硅胶基质的强阳离子交换材料，含有磺酸盐功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阳离子。色谱柱老化：在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。洗脱液：推荐在这类柱上使用的洗脱液是要求低电导的缓冲液，例如柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶pH范围从2.5到6.5，其中有乙二胺作为洗脱阳离子。绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用以前要脱气，并用0.5微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。流量和压力柱内径（毫米）,流速,（ml/min）,最佳,最高2.0,0.2,1.03.0,0.4,2.04.6,1.0,4.010.0,4.7,18.0注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果你想更换柱子，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。样品处理保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。保护柱一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep柱我们建议使用ChromSepCation交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用ChromguardCationexchangeHighEfficiency（高效）柱(10X3.0mm)或HighCapacity（高容量）柱(50X3.0mm)。进样量和浓度柱尺寸长度*内径,最大样品体积250×2.0mm,±10μl200×3.0mm,±15μl250×4.6mm,±50μl250×10.0mm,±250μl当样品的洗提强度比洗脱液低（在柱样品预浓缩）的时候，更高的样品量也可以注射。温度：ChrompackIonoSpherC柱可以在室温环境使用。为了提高柱子的稳定性，建议不要在40°C以上使用。贮存：在贮存柱子以前，建议先用去离子水，然后用甲醇冲洗。一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。检测灵敏度：对于阳离子的检测，建议进行电导率的测定,使用前面提到的低电导洗脱液。柱效损失的可能原因6．额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。7．洗脱的平衡时间不够。8．不正确的洗脱液pH或洗脱液的离子强度。9．洗脱液中存在不正确的阴离子。制备新鲜的洗脱液。10．固定相污染。a.高柱压伴随分辨率降低。4．颗粒物积聚在烧结物或者填充物床上。（a）样品来源---过滤或离心（b）洗脱液来源---过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。（c）系统来源---冲洗整个系统管路和泵；安装在线系统过滤器。5．蛋白质类物质的积聚（a）微生物在样品中生长。（b）微生物在洗脱液中生长。b.正常柱压伴随柱效降低2．有机污染（a）样品中有脂肪，油脂，脂质。固定相的表面被覆盖。（b）从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备的洗脱液。（c）在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物，例如在运输时从大气中带来。对于纠正污染问题的可能有效的操作5．准备新鲜的洗脱液在很多情况下，柱效的丧失可以归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前准备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤，在使用以前要脱气。6．色谱柱再生要进行色谱柱的再生工作a．首先倒转色谱柱b．以0.4ml/min的流速用1M硝酸铵洗脱30ml。c．以0.4ml/min的流速用40：60（v：v）的甲醇/水洗脱30ml。d．以0.4ml/min的流速用异丙醇洗脱30ml。e．以0.4ml/min的流速用水洗脱30ml。f．以0.4ml/min的流速用洗脱液洗脱30ml。g．将柱子转回正常方向。色谱流动相的种类及特性表溶剂的种类及溶剂强度参数ε名称,溶剂强度ε,名称,溶剂强度ε,名称,溶剂强度ε全氟烃,0.25,氯仿,0.40,正丁醇,0.70戊烷,0,丙酮,0.50,二甲基亚砜,0.75己烷,0.01,甲乙酮,0.51,正丙醇,0.82庚烷,0.01,二氧六环,0.56,乙醇,0.88CCl4,0.18,四氢呋喃,0.57,甲醇,0.95苯,0.32,乙酸乙酯,0.58,乙酸,1.00甲苯,0.29,硝基乙烷,0.60,乙二醇,1.11乙醚,0.38,硝基甲烷,0.64,甲酰胺,-二氯甲烷,0.42,乙睛,0.66,水,-常见物质官能团的极性顺序烷基〈卤素〈（F〈Cl〈Br〈I由此可判断出峰顺序。1HPLC的色谱分离机理：疏溶剂理论在反相冲洗色谱中，键合固定相，C8和C18属于非极性的；而流动相，水与乙腈或水与甲醇都属于极性的。各种溶质在色谱系统中的保留或流出顺序不同主要是它们的性质不同：如分子大小及官能团不同；空间构形不同；溶解度及极性不同，极性流动相中，溶质与固定相相互作用；非极性溶质和溶质的非极性部分与极性流动相相排斥并取向有机键合层，在它们之间产生疏水空穴，同时形成一种缔合物。这种缔合物结合力的大小与溶质的表面积和分子偶极矩的大小及极性强度有关；也与流动相表面张力，介电常数有关。由以上基础知识资料可选以下HPLC色谱条件：1、方法提要：本方法适用于特戊酸中控的分析。2、方法来源：金属元素编制3、检测仪器和试剂：仪器：HPLC1200色谱柱：HypersilODS2（200mm×4.6mm×5μm）色谱纯乙腈，超纯水,H3PO4。4、测试条件：柱温：40℃流速：1ml/min检测器：UV=210nm进样量：1.0ul运行时间：25min流动相（梯度程序）：T（min）流动相A（乙腈）流动相B(0.1%H3PO4)0505013901015901015.0150502550505、流动相制备：脱气并滤后使用。6、样品制备：取约15mg样品溶于25ml流动相中。7、定量方法：扣除空白峰后，面积归一化。从峰型以及出峰时间可认为方法可行，但如果样品中含大量水或有机溶剂时，做高效液相色谱(HPLC)就不能说明真实含量了，这时可考虑做化学分析。第四章化学分析方法选择下面介绍化学分析方法选择：先回顾一下化学分析法基础知识。一、化学分析法以物质的化学反应为基础的分析方法，主要有重量分析法和滴定分析法等。1.重量分析法根据某一化学计量反应：X＋R＝P从反应产物（P）的量来计算待测组分（X）的量。如果反应产物是沉淀，则称量沉淀重量，从而计算待测组分的含量。２.滴定分析法（容量分析法）根据某一化学计量反应：X＋R＝P将已知准确浓度的试剂（R）溶液滴加到待测溶液中，直到所加的试剂恰好与待测组分按化学计量反应为止，根据试剂溶液的浓度和体积计算待测组分的含量。3．重量分析法和滴定分析法的选择：重量分析法和滴定分析法适用于常量分析。重量分析法准确度高，常用它作标准分析法。但它操作繁琐，耗时长，目前较少采用。滴定分析法操作简单、快速，使用的仪器简单，测定结果也较高，因此，应用比较广泛。二、试样的分析过程，一般包括下列几个环节：1.取样；2.试样的分解；3.测定；4.计算分析结果，并对测定结果作出评价。取样在实际工作中，要分析的对象往往是很大量的很不均匀的。而分析时所取的试样量是很少的。因此，在分析以前，首先要保证所取的试样具有代表性。常用的缩分为四分法。在一般的分析工作中，先要将试样分解，制成溶液，而后测定。试样的分解是分析工作中的重要步骤之一。在分析试样时应注意下列几点：（1）试样分解必须完全；（2）试样分解过程中，待测组分不应损失；（3）不应引入待测组分和干扰物质；（4）分解试样最好与分离干扰元素相结合。常用的分解试样的方法有以下两类：1.用水、酸、碱等溶剂处理。2.用适当的溶剂与试样在高温下熔融三、测定方法的选择和干扰的消除测定方法不同，干扰情况也不同。以测定某硅酸盐中Fe2O3的含量为例说明。硅酸盐的主要成分为SiO2、Fe2O3、Al2O3、CaO、MgO、TiO2等。用下列几种方法测定，由于测定方法不同，溶液中存在的其它离子对Fe3+测定的干扰情况是不同的。滴定分析很很需要，下面做一介绍（1（一）酸碱滴定法以酸碱反应为基础的滴定分析法。一般酸、碱以及能和酸、碱直接或间接发生质子转移的物质可用酸碱滴定法测定。（二）配位滴定法以配位反应为基础的滴定分析法。（三）沉淀滴定法利用沉淀反应的分析法。目前应用最广的是生成难溶银盐的反应，称为银量法。（四）氧化还原滴定法以氧化还原反应为基础的滴定分析法。（21.按一定的反应式定量进行(99.9%以上)；2.快(或可加热、催化剂)；3.有适当的方法确定终点(指示剂)。置换滴定：用K2Cr2O7标定Na2S2O3(KI返滴定、间接滴定（3一、基准物质：用以直接配制标准溶液或标定溶液浓度的物质1.组成与化学式相符(H2C2O4·2H2O、NaCl);2.试剂纯度>99.9%;3.稳定(Na2CO3、CaCO3、Na2C2O4等）二、常用的基准物质有下列几类：1.酸碱滴定法中常用的邻苯二甲酸氢钾，草酸，碘酸氢钾，碳酸和硼砂等。2.配位滴定法中常用Cu，Zn，Pb等金属，有时也用碳酸钙，氧化镁等。3.沉淀滴定法中应用最广的银量法，基准物为NaCl或KCl。4.氧化还原滴定法中常用K2Cr2O7、As2O3以及Cu、Fe等纯金属5.常用试剂级别级别1级2级3级生化试剂中文名优级纯分析纯化学纯英文标志GRARCPBR标签颜色绿红蓝咖啡色三.标准溶液的配制:标准溶液具有准确的浓度。配制方法有两种：1.直接法。准确称取一定量的基准物质，溶解后定量的转移至容量瓶中，冲释到刻度，根据称取物质的量和容量瓶的体积计算钙标准溶液的浓度。如直接配制：K2Cr2O7、KBrO32.标定法。先称取一定量试剂配成接近所需浓度的溶液，然后用基准物质测定它的准确浓度。这种操作叫做标定。如标定法配制：NaOH、HCl、EDTA、KMnO4、I3-举例：酸标准溶液:HCl(HNO3,H2SO4)配制：用市售HCl(12mol·L-1),HNO3(16mol·L-1),H2SO4(18mol·L-1)稀释.标定：1.Na2CO3,270-300℃烘1hr,MO或MR+溴甲酚绿(△);2.硼砂(Na2B4O7·2H2O（NaH2BO3+2H3BO3),60%相对湿度保存,防失水.pHep=5.1,MR.NaOH标准溶液的配制与保存配制:浓NaOH(饱和,含量约50%,约19mol·L-1)中Na2CO3沉淀除去,再用煮沸除去CO2的去离子水稀释至所需浓度标定:1.邻苯二甲酸氢钾(KHC8H4O4),Mr=204.2，pKa2=5.4,PP,称小样,平行3份.2.草酸(H2C2O4·2H2O),Mr=126.07，pKa1=1.25,pKa2=4.29,PP,称大样.保存:浓溶液装在带碱石灰[Ca(OH)2]的瓶中,从虹吸管中取;稀溶液注意用橡皮塞塞紧.滴定方法的选择：【一】酸碱滴定法酸碱反应涉及的反应是酸碱反应。该反应的特点是：(1)反应速度快；(2)反应过程简单,副反应少；(3)可以从酸碱平衡关系估计反应进行的程度；(4)滴定过程中溶液的H+发生改变,有多种指示剂可供选择指示化学计量点的到达对于酸碱的定义：按布朗斯台德的酸碱定义，凡能给出质子（H+）的物质是酸，凡能接受质子的物质是碱。常用缓冲溶液的配制方法1.按比例加入HA和A(NaAc+HAc,NH4Cl+NH3);2.溶液中[H+]大,加过量A-,溶液中[OH-]大,加过量HA;3.溶液中有HA,可加NaOH中和一部分,溶液中有A-,可加HCl中和一部分.缓冲溶液浓度的计算方法有:缓冲容量法、缓冲溶液pH计算式法、及摩尔分数法.（一）酸碱滴定法指示剂的选择1、酸碱指示剂的作用原理酸碱指示剂是有机弱酸或有机弱碱，它们的共轭酸碱对具有不同结构，因而呈现不同颜色。改变溶液的pH值，指示剂失去或得到质子，结构发生变化，引起颜色的变化。例如甲基橙是一种双色指示剂，在溶液中有下式平衡和相应的颜色变化，增大溶液的[H+]，若以Hin表示指示剂的酸式型体，其颜色称为酸色，In-表示指示剂的碱式型体，其颜色称为碱色。指示剂在溶液中建立下式平衡：HInH++In-KHIn是指示剂的离解常数，简称指示剂常数。溶液呈现的颜色取决于[In-]/[HIn]值，对某种指示剂来说，在指定条件下，KHIn是常数，因此[In-]/[HIn]决定于溶液的[H+]。由于人眼对颜色的分辨能力有一定限度，只有当pH值从pKHln-1到pKHln+1时,可以明显地看导指示剂从酸色变到碱色。这个范围称为指示剂的变色范围.2、影响指示剂变色范围的因素影响指示剂变色范围的因素是多方面的.对单色指示剂,指示剂的浓度有较大影响．对双色指示剂，指示剂的浓度不会影响指示剂的变色范围。但是如果指示剂用量过多，会使色调变化不明显，同时指示剂本身也要消耗滴定剂，因而引入误差．温度对指示剂变色范围也有影响。当温度改变时，指示剂的离解常数和水的质子自递常数都有改变，指示剂的变色范围也随之改变。酸碱指示剂Acid-baseIndicators序号(No.),名称(Name),pH变色范围(pHtransitioninterval),酸色(Acidcolor),碱色(Basecolor),pKa,浓度(Concentration)1,甲基紫（第一次变色）,0.13～0.5,黄,绿,0.8,0.1%水溶液2,甲酚红（第一次变色）,0.2～1.8,红,黄,-,0.04%乙醇（50%）溶液3,甲基紫（第二次变色）,1.0～1.5,绿,蓝,-,0.1%水溶液4,百里酚蓝（第一次变色）,1.2～2.8,红,黄,1.65,0.1%乙醇（20%）溶液5,茜素黄R（第一次变色）,1.9～3.3,红,黄,-,0.1%水溶液6,甲基紫（第三次变色）,2.0～3.0,蓝,紫,-,0.1%水溶液7,甲基黄,2.9～4.0,红,黄,3.3,0.1%乙醇(90%)溶液8,溴酚蓝,3.0～4.6,黄,蓝,3.85,0.1%乙醇（20%）溶液9,甲基橙,3.1～4.4,红