病原生物与免疫学实验教材 免疫实验三：免疫标记技术、免疫细胞分离等-陈玮琳、翁莉霞教学课件

医学免疫学实验

实验三（一）免疫标记技术

1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）

2、斑点免疫层析试验（二）免疫细胞的分离与纯化

1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（三）免疫细胞功能测定

1、E玫瑰花环试验（示教）

2、淋巴细胞转化试验（示教）（四）结核病相关的免疫试验简介（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）

待检标本标准品稀释孔

阴性对照“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：

（一）免疫标记技术【概念或原理】：利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或抗体的量或其存在与否。【分类】

荧光免疫技术酶免疫技术→ELISA（双抗体夹心法

）放射免疫技术金免疫技术→斑点免疫层析试验化学发光免疫技术等

Ag＋Ab

荧光素Ag－Ab－荧光素＋Ab

荧光素（？）＋Ab－荧光素（洗涤）免疫标记技术举例：（细胞表面可见荧光）6cellswithfluorescencetuberclebacilluswithfluorescence8酶免疫技术酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体ELISA

(酶联免疫吸附试验，enzyme-linkedimmunosorbentassay)

sandwichELISAtodetectAg√indirectELISAtodetectAb

competitiveELISAtodetectAborAg

1）已知抗体包被

2）洗板

3）加待检抗原标本

4）洗板

5）加酶标记抗体

6）洗板

7）加底物显色，测定

(measurecolor)

10（显色）（不显色）（定量）(noAg

)

(Ag

)polystyreneSandwichELISA(todetectAg,双抗体夹心法，原理)（封闭的意义）（一）免疫标记技术

1、酶联免疫吸附试验(ELISA)

------双抗体夹心法请按照实验指导讲义方法进行操作，第5-9步；第5、7步孵育时间由60min改为30min；结果肉眼判断第5步按下页PPT的图加样，加6个孔，37℃，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）

待检标本阳性对照阴性对照“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：13(IndirectELISAtodetectAb)14（一）2、斑点免疫层析试验

(dotgoldimmunochromatographicassay，DICA)the"rapidtests"thatyoumightusetodetectpregnancy,ordiagnoseaninfectionquicklyinadoctor'soffice.16BCTRA(Nitrocellulosemembrane)金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素）固相特异性抗体（抗HCG）固相抗小鼠IgG抗体

阳性：T区、R（或C）区均出现红色线条（两条红线）；阴性：T区不出现红色线条，仅R（或C）区出现红色线条（一条红线）。1718

positivenegativeinvalid斑点免疫层析试验请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果

（二）免疫细胞的分离与纯化

1.

密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（二）1.外周血单个核细胞的分离

密度梯度离心法[原理]1）人外周血中红细胞、粒细胞密度1.092左右，单个核细胞为1.075~1.090。根据各类血细胞比重的差异，分离得到单个核细胞。2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，可进一步分离得到淋巴细胞。

离心前离心后抗凝血分离液血浆层单个核细胞层分离液红细胞、粒细胞（白色云雾状，薄层）Mainmethod:AnticoagulatedbloodarelayeredonthetopofFicoll(lymphocyteseparationmedium),horizontalcentrifugation,Fourlayers:plasma,lymphocytes,Ficoll,granulocytesandredbloodcells;(figure)Collectlymphocytes.23[方法]1.每桌（4人，2组）准备抗凝血1份（约4ml）；（已做，用前混匀）2.将分层液（淋巴细胞分离液）加入试管（已做）3.每组用吸管吸取肝素抗凝血约2ml缓慢加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁缓慢加入）；4.水平离心(2000rpm,20min)；[方法]5.将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层，置另一干净试管内；6.洗涤单个核细胞2次(加入约1mlHanks’液,混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒去上清；重复1次)；7.用残留上清(或加Hanks’液约0.1ml)重悬获得的单个核细胞，备用；8.吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细胞为主）Lymphocytes(淋巴细胞)Lymphocytes淋巴细胞normal

smalllymphocyteinbloodsmear(血片中淋巴细胞)lymphocyte

（三）免疫细胞功能测定

1、E花环试验

原理：T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞，

可用来鉴定和计数T细胞

＋＋T细胞SRBC花环形成细胞B细胞SRBC＋（60～80％）CD2

E花环形成率=

形成E花环细胞数形成E花环细胞数+未形成花环细胞数×100%总E花形成率：60~80%活性E花形成率：25~40%rosetteforming

cellT

cell

显微镜下观察花环形成细胞，310室，不要求计算E花环形成率。

（三）2、淋巴细胞转化试验PHAT淋巴细胞（小细胞）淋巴母细胞

Tcell

lymphoblast(smallcell)(largecell)

BcellrestingBcell(smallcell)(Untransformed

lymphocytes)(transformedlymphocytes)(转化的淋巴细胞)(未转化的淋巴细胞)PHAPHA

转化率=

转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数×100%TcellsTcells+Bcells×100%（60~80%）核分裂相细胞过渡型细胞转化的淋巴细胞包括以下三种细胞：（1）淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细网状。核内见明显核仁1～4。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。（2）过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。（3）核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见许多对成堆或散在的染色体。

Lymphoblast(typical,morphologicalfeatures):Lymphoblastsare12-20µmindiameterwitharoundtoovalnucleus,sometimeseccentricinlocation.Thenucleustocytoplasmratioisabout4:1andtheperipheryofboththenucleusandthecellmaybeirregular

inoutline.Thefine,highlydispersednuclearchromatinstainsalightreddish-purple,andoneortwopaleblueorcolorlesslargenucleoliarevisible.Thecytoplasmisusuallyagranularanddeeplytomoderatelybasophilic,withmarginal(peripheral)intensityacommoncharacteristic.(Smallrestinglymphocytesare6-8µmindiameter)41Smalllymphocytestransformedlymphocytes

(lymphoblasts,largecells)mitosismetaphase(Ag

ormitogen)stimulation①untransformedlymphocyte,small②transitionalcell③typicallymphoblast①③②untransformedlymphocyteLymphoblast,(transformedlymphocyte)核仁图1狗外周血中的淋巴母细胞

显微镜下观察典型淋巴母细胞，不要求计算淋巴细胞转化率。（四）结核病相关的免疫试验

(免疫学检测技术在疾病诊断中的应用举例)

1.肺结核诊断需要做哪些检查：（1）结核菌检查：痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。镜检（抗酸染色，荧光染色）；培养法（传统或Bactec法等）；PCR法查痰；其他（ELISA）

（2）影像学检查：胸部X线检查不但可早期发现肺结核，而且可对病灶作出判断，对决定治疗方案很有帮助。胸部CT检查对于发现微小或隐蔽性病变，了解病变范围及组成，对于诊断是有帮助的。

（3）结核菌素（简称结素）试验：

IV型超敏反应；阳性表明机体受到（或曾经）结核菌感染或接种过卡介苗，也表示机体对结核菌有一定免疫力

（4）其他检查：血沉，CRP(免疫比浊法)等，在评价肺结核病情活动性有一定的价值。

2.肺结核检查中免疫相关实验：（1）结核菌检查：荧光染色镜检找结核菌；

（2）结核菌素（简称结素）试验用于诊断结核菌感染的皮肤试验。为IV型超敏反应，迟发型超敏反应：

原理：抗原(结核菌或卡介苗)进入机体使机体的免疫T淋巴细胞致敏，并大量分化增殖。当已致敏的机体再次遭受到抗原入侵时，致敏淋巴细胞就会与之结合，引起变态反应性炎症。表现在结核菌素注射部位形成硬结甚至发生水泡、坏死。阳性表明机体受到或曾经受到结核菌感染或接种过卡介苗；阴性可能免疫力低下或卡介苗接种失败或未感染过结核菌，也可能技术原因而呈现假阴性；阴性大多可除外结核感染。

结核菌素（结素）试验类型OT试验：前臂皮内注射OT，5IU。旧结素（oldtuberculin，OT）是从生长过结核菌的液体培养基中提炼出来的结核菌代谢产物，主要含有结核蛋白。注射后分别于24、48、72小时观察反应一次（以72小时的结果为准）。局部硬结小于5mm为阴性，5－9mm为弱阳性，10－19mm为阳性反应，20mm以上或局部发生水泡与坏死者为强阳性反应。PPD试验：前臂皮内注射PPD，5IU。结素的纯蛋白衍化物（purifiedproteinderivative，PPD）为纯结素，不产生非特异性反应。硬结平均直径≥5mm为阳性反应。阳性的意义：阳性表示曾感染结核