生物课件第九章 基因工程和基因组学

第九章基因工程和基因组学

遗传工程或基因工程，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。本章介绍遗传工程的基本原理和方法，基因组学的发展及应用前景。广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指:基因工程(重组DNA技术)。

一、基因工程概述:第一节基因工程１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式

按照预先设计的蓝图

借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去

使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。2.发展：1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和l噬菌体

DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来

得到

新的DNA分子。1973年，

Cohen等进一步将酶切后的DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年为2780万公顷，1999年达到3990万公顷，2000年达到4420万公顷，2001年达到5260万公顷，2002年达到5000万公顷。2001年种植面积已超过100万公顷的作物有：大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2，占19%）、棉花（680万hm2，占13%）、油菜（270万hm2，5%）；其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已实现商品化。主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。2001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。3．内容：①．从细胞和组织中分离DNA；②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③．将酶切DNA分子与载体DNA连接构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制；⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体；⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向的性状变异的个体。1.限制性内切酶(restrictionenzyme)：一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。

细菌细胞中存在限制修饰系统：限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。二、限制性内切核酸酶限制性内切酶EcoRⅠ：识别序列：回纹对称序列(palindrome)，不同生物的DNA具有相同识别序列。酶切方式：以交错方式切断DNA双链，产生二个相同的单链粘性末端。重组过程：两种片段在适宜条件下，可经碱酸二脂链，连接成重组DNA分子。⑴．限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；②.HindⅢ来自Haemophilusinfluenzae。①.EcoRI来自Escherichiacoli；⑵．限制性内切酶的类别：第Ⅰ类酶:每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性,酶切位点不定。

如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子。第Ⅱ类酶:能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。如EcoRI(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000-100000)，作用时需Mg2+存在。第Ⅱ类酶特点：(1)切割产生平末端(bluntends)如SmaⅠ：(2)有的产生粘性末端从两个方向阅读而序列相同的序列。识别特定碱基顺序，为回文对称序列,又称反向重复序列：如EcoRⅠ：载体：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。DNA片段与适合的载体DNA连接构成重组DNA在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。三、载体（vector）：载体的条件：①.具有复制原点，能自我复制；②.具多克隆位点(multiplecloningsite，MCS或Polylinkerregion)即有多种限制酶的切点；③.选择时的遗传标记，如抗生素基因；④.易从宿主细胞中回收。㈠、细菌质粒：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。在细胞内的复制程度：严紧型：一个细菌细胞内的质粒数量有1-2个；

松驰型：每个细胞内有的20-60个。如pUC18质粒具有以下特点：③.克隆位点的酶切位点多，克隆方便；④.具有a－互补的显色表型，用于检测重组质粒的选择标记。①.分子量小，可接受较大外源片段；②.拷贝数多，每个细胞中有500个；噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作为cDNA或核DNA克隆的载体。㈡、λ噬菌体(温和型)：基因组全长49kb。优点：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖；1.携带大片段外源DNA分子，可占用总量的25%时仍不失活。㈢、柯斯质粒(cosmid)：部分λ噬菌体DNA+

部分细菌质粒DNA序列组建柯斯质粒。带有噬菌体cos序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用。∵一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。指能在两种不同的生物中复制的载体。如能在原核生物（如E.coli）、真核细胞（如酵母）中复制的载体。穿梭载体需同时具有细菌质粒的复制原点、真核生物自主复制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及两者的选择标记。㈣、穿梭载体（shuttlevectors）：穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中用于基因表达分析。酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)和YRp系列载体均是穿梭载体。穿梭质粒YEp24㈤、细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)BAC载体可以携带大于50kb的外源DNA片段。特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小(7.4kb)；选择标记：氯霉素抗性基因；

多克隆位点。F因子经基因工程改造成BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。㈥、酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)：YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定㈦、Ti质粒及其衍生载体：适合于植物的载体系统将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌(革兰氏阴菌)(Agrobacteriumtumefaciens)细胞中可诱导植物产生瘤细胞(tumor-Inducing,Ti)冠瘿瘤(growngalltumors)。Ti质粒一部分DNA叫转移DNA

(transferDNA，T-DNA)，当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱(opine)，作为农杆菌的碳源和氮源。农杆菌感染产生冠缨瘤一般而言，一个基因

是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。

在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。四、基因的分离与鉴定：利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程提供目的基因。1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接；2.目标DNA分子+载体DNA，共价连接；3.获得重组DNA分子。DNA的体外重组：㈠、从基因库中分离基因：1.构建基因库（library）基因库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。①.核基因库：核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。构建文库可采用不同的载体：

质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。噬菌体或(柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬菌体，感染细菌，收集噬菌斑。BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。

②.染色体基因库：将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割，构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线染色体带的分析。人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离(flowcytometry)技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。流式细胞分离原理分离后的染色体进行涂色验证酵母菌：利用改良的脉冲电泳方法(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)，将酵母菌16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。③.cDNA库：以mRNA为模板经反转录酶合成互补DNA构建基因库。真核生物mRNA的5’端具有一段多聚A尾端序列得到的双链DNA分子经两端补齐后以带有限制性酶切点的人工接头连接酶切后与载体(通常是噬菌体)连接制备cDNA库。cDNA库与核DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列仅包括基因组的部分基因序列。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。2.筛选基因库：根据待选基因相关信息

确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针

筛选基因库。筛库过程：将转化或转染后菌落印影在滤膜上用碱裂解、中和后洗涤烘干再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交放射性自显影凡黑点菌落即为阳性克隆。①.限制性酶图谱：构建阳性克隆的限制性酶图谱

根据同源性分析，可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置

用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。3.阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆

分析、鉴定

得到目的基因。图示：一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。将阳性克隆DNA分装3个管中酶切DNA琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色紫外灯下见到DNA带。

从凝胶电泳结果分析：模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。②.核酸分子杂交：Southern杂交分析：由英国的Southern发明(1975)，一种将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆后将限制性酶酶切与Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。Northern杂交分析：与Sorthern杂交相同的原理和程序。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。Western杂交分析：用于蛋白质的分析。③.核酸序列测定克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后确定该DNA片段序列的正确性。一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：④.核酸序列分析：测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。（1）同源性比较将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性，将序列发送到Blast等DNAData数据库进行比较。核酸序列分析方法：对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起始信号和终止信号等。（2）分析核酸序列的阅读框架PCR反应三个步聚(一个循环)：1.变性：94-95℃使模板DNA双链变成单链；2.复性：50-70℃下，引物分别与互补的DNA单链互补配对；3.延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，于72℃下合成模板DNA的互补链。PCR反应通常有25-35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。由该技术衍生出一些新的技术，如RAPD和AFLP等技术。㈡、PCR扩增基因：聚合酶链式反应(polymerasechainReaction，PCR)可以体外快速扩增DNA。美国Mullis(1986)发明，是现代生物学发展史上的一个里程碑。㈢、人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来可很快地人工合成基因。如SOE-PCR技术可扩增出完整的基因序列。1.化学合成的寡聚核苷酸(80-100个核苷酸)通过SOE将单链部分补齐；2.PCR扩增DNA片段；3.DNA变性；4.两个单链部分经SOE补齐双链；5.PCR扩增DNA，利用多级SOE-PCR扩增出完整的基因。目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。五、基因工程的应用：具有生长激素的转基因鼠转基因的方法和技术：㈠、基因工程工业：最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。现已在细菌中生产10多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗等。有些真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统真核生物细胞更适合于表达真核生物蛋白质基因。目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞成功地均应用于表达外源蛋白。基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素㈡、植物基因工程：植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化法和基因枪转化法。抗虫稻对照1.根癌农杆菌转化技术：根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒

再转化到农杆菌细胞

将重组农杆菌去感染植物细胞

使质粒的部分DNA包括目的基因，整合到植物染色体，实现遗传转化。利用从抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分离克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。基因枪介导的植物转化是通过高压气体为动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒将目的基因直接导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。2.基因枪转化技术：转化的载体多数是以pUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记(如除草剂、潮霉素等抗性)。几种基因枪类型的共同特点：是用一种动力系统将金属微粒和包被DNA导入受体细胞或组织进行转化。1.位于高压气体桶底部的爆破片；2.载有重组DNA和金属微粒的大载体；3.阻挡板；

4.包裹有重组DNA的金属微粒；5.被轰击样品。㈢、转基因动物:与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。转基因动物：目的基因+载体重组DNA微量注射法将重组DNA导入受体合子细胞核中遗传转化。如：利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶。

可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”(下图)。(Wilmut等，Nature385,1997)受精卵细胞注射法转基因牛：受精卵注射法人类生长激素转基因猪同胞鼠对照转移有人类生长激素转基因鼠㈣、遗传疾病诊断：利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断准确度高，速度快。进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。如：镰刀性贫血病的诊断㈤、基因治疗：利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗(genetherapy)。方法：利用减毒的病毒DNA作载体(retrovirusDNA)构建重组DNA分子用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞将正常基因整合到染色体上。例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脱氢酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突变引起的，患者无任何免疫功能。方法：将ADA基因导入到MLVretrovirus载体中取代该病毒DNA中的三个基因结构(gag、pol、env)将重组后的病毒去感染T细胞，使ADA基因整合到T细胞的染色体中实现基因治疗的目的。2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿(8个月和11个月)。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。㈥、DNA芯片(DNAchips)：核酸分子杂交的原理和方法+半导体技术结合发展形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。

DNA芯片技术：在面积不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地点阵排列于一定位置可寻址的核苷酸分子将待分析核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号计算机软件分析。DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龙等。应用领域：基因多态性检测（如单核苷酸多态性筛选singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表达分析（不同细胞和不同组织的RNA群体比较）；

克隆选择及文库筛选（如cDNA文库）；基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。第二节基因组学基因组学(genomics)：遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体内基因组的分子特征。研究对象：以整个基因组为研究单位，而不以单个基因为单位作为研究对象。研究目标：认识基因组的结构、功能和进化；

阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系；

充分利用有效资源，预防和治疗人类疾病。重要组成部分：基因组计划(genomeproject)大体上可分为：⒈构建基因组的遗传图谱；⒉构建基因组的物理图谱；⒊测定基因组DNA的全部序列；⒋绘制基因组的转录本图谱；⒌分析基因组的功能。基因组计划研究开始于1990年。美国启动被誉为“人体阿波罗计划”的“人类基因组计划”，投资30亿美元，历时15年测定人类基因组的30亿个核苷酸对的排列次序构建高分辨率的人类基因组遗传图谱和物理图谱发展生物信息学。在美国提出人类基因组计划后，日本和中国分别于1991年和1992年启动了“水稻基因组计划”。由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，也受伦理学的约束，所以人类基因组计划还将对有关的模式生物，如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥等进行相应的研究，为研究人类基因组的战略提供重要的依据。2002年4月5日《Science》以14页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立绘制完成水稻基因组草图序列（总数：4.6亿），是继人类基因组工作草图（2001年春）之后完成测定的最大基因组。（2001年12月14日美、英等国科学家宣布绘制出拟南芥基因组的完整图谱）材料：籼稻。完成单位：华大基因研究中心，中科院遗传与发育生物学研究所等12个单位，2001年7月启动。水平：水稻基因组中的总基因数约为46022~55615个（接近人类基因数的两倍），工作框架图序列已覆盖水稻整个基因组92％以上的基因。方法：“鸟枪射击法”，利用国产曙光2000、曙光3000超级计算机(1000亿次/秒)对随机DNA碎片进行排序和组装，确定其在基因组的正确位置。计划：功能基因分析和蛋白质研究。2002年11月21日《Nature》宣布中国科学家独立绘制完成粳稻基因组第四号染色体精确测序图，使我国对国际水稻基因组测序计划贡献率达到10%。材料：粳稻“日本晴”。完成单位：中科院国家基因研究中心等4家单位。整个国际水稻基因组计划始于1998年，日本、美国、中国、法国等国家和地区参加。水平：第四号染色体中的总碱基数目为0.35亿碱基对，覆盖了该染色体全长序列98％的区域，只剩下7个小空洞，测序碱基序列的精确度达到99.99%。完整测定的着丝粒序列在高等生物中属于首次。计划：对预测鉴定的4658个基因作进一步分析、着丝粒功能等研究。一、基因组图谱的构建解决方法：大规模序列测定前，构建基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。基因组中核苷酸顺序的测定方法：小基因组物种常用鸟枪法测序法。大基因组测序存在两个问题：片段数(n)庞大，片段间连接和装配非常复杂；基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时容易出错。测序方法：克隆连续序列法(clonecontig)：将基因组DNA切割长度为0.1Mb-1Mb的大片段克隆到YAC或BAC载体上分别测定单个克隆的序列再装配连接成连续的DNA分子。定向鸟枪射击法(directedshotgun)：以基因组图谱中标记为依据测序装配和构建不同DNA片段的序列。基因组图谱根据构建的途径，可分为两种：遗传图谱：根据遗传性状(如已知基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表型性状)的分离比例将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱。物理图谱：将各种标记直接定位在基因库中的某一点上。

㈠、遗传图谱的构建：1.图谱标记：可用基因和DNA作为可鉴别的标记(mark)。缺点：基因数目有限、所构建的遗传图谱不详细、标记间的遗传距离较大。⑵.DNA标记：每种生物DNA具有稳定性，∴DNA本身可作为构建遗传图谱的标记，主要有以下3种类型：①.限制性内切酶多型性:②.简单序列长度多型性③.单核苷酸多型性⑴.基因标记：基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记，2、遗传图谱的构建：⑴.人类基因组遗传图谱的构建：家系分析法：分析8个家系134个成员(186个减数分裂)根据5264个STR(简单重复序列)标记绘制而成（对于X染色体，另外利用12家系的170个成员分析(105个减数分裂)）将5264个标记定位在2335个位点构建的人类基因组遗传图谱密度为每个标记599Kb。⑵.植物基因组遗传图谱的构建：①.选择亲本：要求亲缘关系远，遗传差异性大，亲本间分子标记具有多态性。

②.产生构图群体：配制杂交组合，建立分离群体：利用回交或三交(复交)产生的后代群体。单交组合产生的F2；衍生的F3、F4家系；由连续多代自交或姊妹交产生的重组近交系(recombinantinbredLines，RIL)；.通过单倍体加倍而成的双倍体(doubledhaploids，DH)；.③.遗传标记的染色体定位：有单体、三体、代换系与附加系分析等方法，依据染色体剂量的差异将遗传标记定位在特定染色体上。即当供体材料总DNA等量时，DNA杂交带的信号强弱与该标记位于的染色体剂量成正比。④.标记间的连锁分析：通过分析分离群体内双亲间有多态性的遗传标记间的连锁交换情况和趋于协同分离的程度即可确定标记间的连锁关系和遗传距离。(二)、物理图谱的构建：1.构建物理图谱的原因：⑴.遗传图谱的分辩率有限：⑵.遗传图谱的精确性不高：2.构建物理图谱的三条途径：⑴.

限制性酶图谱：利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA分子长度<50Kb的片段，一般没有什么困难。而对于>50Kb的DNA分子，可选用稀有切点内切酶酶切DNA。⑵.荧光原位杂交是另一物理图谱构建方法通过荧光标记的探针与DNA分子杂交，使染色体上的杂交信号（位置就是探针DNA在染色体上的图谱位点）在显微镜下可直接观察。⑶.序列标签位点：利用某一已知序列为标签的位点(sequencetaggedsites，STS)作探针，与基因组DNA杂交，绘制物理图谱。3.人类基因组物理图谱:人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个，各代表一个基因。再从中筛选出3万个EST、二个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、一个有32000个克隆的YAC文库用于构建图谱。结果构建的物理图谱的密度为每个标记183kb，EST分布结果表明基因在染色体上的排列是不均匀的。将上述遗传图谱及其它物理图谱整合构成更加完整的人类其因组图谱，作为基因组序列测定的框架和分析的依据。二、基因组图谱的应用：基因组图谱中除了构建遗传图谱和物理图谱外，还可进一步根据标记类型细分为不同的称谓。如RFLP图谱、RAPD图谱、AFLP图谱等，目前已在拟南芥、番茄、水稻等30多种植物中构建了基因图谱。基因图谱的构建除了进行测序之外，还有许多的用途。1.基因定位：借助基因组图谱，可使基因定位在精度、深度、广度等方面有极大的提高。已陆续在各种农作物上定位了许多重要农艺性状和经济性状的基因，在复杂数量性状位点(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大进展。2.基因组比较分析：已经在禾本科玉米、水稻、高梁、大麦、小麦和黑麦，茄科的蕃茄、胡椒、马铃薯，十字花科拟南芥、甘蓝、花椰菜、油菜等做了遗传图谱比较分析，从分子水平了解物种间同源性，研究基因组的进化和染色体的演变。3.标记辅助选择(marker-assistedselectionMAS)：饱和基因组图谱可用来确定与任何一个目的基因紧密连锁的分子标记根据图谱间接选择目的基因，可降低连锁累赘，加速目的基因的转移与利用，提高回交育种的效率。4.基因的克隆与分离：根据饱和的基因组图谱，可以找到一个与目的基因紧密连锁的分子标记，作为染色体步行(chromosomewalking)起始点进行基因的克隆和分离，此法亦称图位克隆法(map-basedcloning)，为基因产物未知的基因克隆提供了捷径。是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上进一步研究全基因组的基因功能、基因之间相互关系和调控机制为主要内容的学科。目前人类基因组计划已测定了人类基因组序列中85%以上的核苷酸序列，将计划完成全序列测定的时间从2005年提前到2003年。2001年4月26日，公布了人类基因序列框架草图。三、后基因组学(post-genomics)：自从1996年酵母菌基因组全序列测定以来，全世界已有1000多个实验室、5000多名科学家从事酵母菌后基因组学的研究，共发表论文7000多篇，鉴定1060个新基因的功能，但仍然还有约1600个阅读框架的功能不清楚。后基因组学主要技术：

DNA微列阵技术；蛋白质组学；酵母菌双杂交系统；生物信息学等技术。1.DNA微列阵(DNAmicroarrays)：是利用DNA芯片技术同时进行大量分子杂交，分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。2.蛋白质组学(proteomics)：是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。蛋白质组学比基因组学更为复杂.∵真核生物的基因表达受转录因子控制，转录因子需与启动子区域的DNA结合并激活RNA聚合酶转录。转录因子具有DNA结合及激活转录两功能，分别由不同区域完成，而且将这两部分分割成两个片段后仍由互作能装配成一个完全有功能的转录因子。基于这一特点，设计出酵母双杂交系统。是利用酵母菌同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。3.酵母菌双杂交系统(twohybrid-systems)：4.生物信息学(bioinformatics)：是一种用计算机贮存原始资料，分析生物信息，将DNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息学是现代生物技术与计算机科学的结合，收集、加工和分析生物资料和信息。生物信息学是在未来生命科学中起关键作用的学科之一。应用生物信息学可以将来不同的基因组理论和应用综合并标准化，利用大量的生物信息资料来了解遗传网络系统、信号传递及相互关系，计算机还可进行一些生物模拟研究。∴利用生物信息学能够分析从微生物、植物以及人类基因组序列测定产生的大量资料阐明遗传信息。1.遗传工程：细胞工程中核移植与体细胞克隆技术。本章小结载体条件与限制性内切酶；目的基因获取与体外重组；转基因技术及其应用；2.基因组学：后基因组学：DNA芯片技术、蛋白质组学、生物信息学等。基因图谱构建：遗传图谱和物理图谱的构建；基因图谱应用：基因定位、比较基因组学、MAS、基因克隆；我劝一个草率结婚的朋友离婚。她平静的告诉我，如果说当初鲁莽结婚是个错误。那么，现在草率离婚是一错再错。这位朋友后来还是离婚了，大家一致认为她的行为很理性。

同样的故事正在互联网搜索巨头谷歌身上发生，但是谷歌选择了草率“离婚”。

饮鸩止渴

由于急于抑制苹果iphone手机翻天覆地的产业冲击，谷歌采取急功近利的粗糙型开放策略。饮鸩止渴的策略一时取得了成果。市场研究公司尼尔森最近公布的数据显示，在通过VerizonWireless、AT&T和SprintNextel三大运营商经销后，谷歌Android手机在美国市场上的销售量已经超过iPhone。另一家市场研究公司iSuppli甚至认为，全球范围内使用Android操作系统的手机数量将在2012年超过苹果iPhone。

表面繁华的背后，是Android生态系统的一团糟，谷歌正在为自己的粗放型开放策略买单。

用户对谷歌手机的态度从开始的好奇、后来的犹豫，变成强烈的批评。“大多Android手机程序都是垃圾，乱七八糟的”，一位手机发烧友迅速投奔了iphone的阵营：“同样的植物人大战僵尸游戏，在谷歌手机和iphone手机上的体验简直没法比”

混乱，还是混乱。一切一切的乱象，折射出谷歌已经失去对Android生态系统的控制。这一切的根源，我的判断是开放策略初期过于宽松，导致失去控制权。混乱的生态系统表现在用户手机上，就是应用程序的混乱和粗燥。

一错再错

为此，谷歌开始采取对策。最近，有国内厂商称新的Android3.0开始关闭应用程序的API(应用程序编程接口)，统一Android界面。这意味着，谷歌将放弃其初始开放策略，开始封闭管理。

粗看之下，谷歌认识到自己的错误。既然是过度开放导致的错误，那么收紧开放尺度是很自然的逻辑，无懈可击。但我认为，谷歌仓促收紧开放策略仍然是个错误。打个比喻。如果过度开放的政策是草率结婚，那么草率的封闭就是草率离婚。这么判断的原因很简单，谷歌把Android开放出去的那一天，Android已经不属于谷歌。谷歌没有认识到这一点，还以为Android只是自己的。

合作伙伴对谷歌封闭政策的反应加强了我的判断结论。经济观察报报道，国内第一家生产基于Android平台手机的设计公司创杨通信，近日已经被迫出售。创杨通信负责人给出的出售理由是，“因为不愿意甘当炮灰而选择放弃。”

按照目前Android3.0将统一界面的想法，未来的手机市场将出现毫无差异化的产品。这对于企业来说，几乎意味着不可避免的价格战。利润空间的微薄，导致合作伙伴生存环境恶劣。于是大量退出几乎是一种必然。

除了为合作伙伴找到新的利益空间，谷歌还将面临开放阵营精神层面的声讨，这对谷歌的挑战会更大。如果说谷歌为了自己竞争的私利利用了开放，赢得了名声。那么，谷歌不能一脚把开放踢开，他现在还需要为这种名声买单。

如果只顾自己收网，谷歌会被面临铺天盖地的道德谴责。谷歌，希望你准备好了，三思而行。

木桶效应就是指一个水桶无论有多高，它盛水的高度取决于其中最低的那块木板。这在选购手机的时候也同样适用。尤其是很多用户在购买手机的时候，都会专注于某一个参数，比如要求处理器主频要高达1GHz，但一部手机的整机表现是由多个因素组成，所以在购买手机的时候一定要从整体的角度上来看一部手机的性除了处理器主频以外，其实还有很多影响整机表现的元素，比如运行内存(RAM)、机身内存(ROM)、操作系统、厂商对系统的优化都会有所影响。不过在很多用户眼中，这几项却远没有处理器主频重要。而如果忽略这几项的话，可能买到一个主频很高，但整机性能却仍然不令人满意的机型。

用户在选机过程中切勿只关注一个硬件参数，这样很可能并不能买到一款理想的机型，就算买的手机主频再高，运行内存低的话仍然无法同时运行数个程序、机身内存小的话则无法把太多的软件安装到机器上，这对整机耗电和运行速度方面都有所影响、而厂商优化更是决定着一部手机的稳定性和部分运行速度。综上所述，大家在选购手机的时候一定要综合考虑一款手机的硬件规格。除此之外，也不要把硬件看的太过重要，就比如苹果iPhone3GS在硬件配置上并不出众，但却在操控手感以及软件资源上目前难有机型企及。更高分辨率能获得更为逼真细腻的显示效果，所以对于屏幕的分辨率绝大多数人都会偏向于分辨率更高的机型。但对于笔者所说的高分辨率未必是好事会有所怀疑。其实这里说的高分辨率“不好”更多是指采用非主流的高分辨率机型。在此前，就有几款“悲情”机型在分辨率上吃了不小的亏。

大名鼎鼎的HTCDiamond就是一款颇具代表意义的机型，Diamond上市的手机市场还处于QVGA时代、只有少数旗舰机皇采用WVGA这样级别的屏幕，由于HTCDiamond却采用了VGA这一过渡型的分辨率，而也正是因为这一点，Diamond很多软件都未有支持或无法完美运行，可谓是一个不小的遗憾。除此之外，曾经非常经典的

附赠人生心语人生太短，聪明太晚人生太短，聪明太晚(1)

我们都老得太快

却聪明得太迟把钱省下来，等待退休后再去享受结果退休后，因为年纪大，身体差，行动不方便，哪里也去不成。钱存下来等养老，结果孩子长大了，要出国留学，要创业做生意，要花钱娶老婆，自己的退休金都被拗走了。人生太短，聪明太晚(2)

当自己有足够的能力善待自己时，就立刻去做，老年人有时候是无法做中年人或是青少年人可以做的事，年纪和健康就是一大因素。小孩子从小就告诉他，养你到高中，大学以后就要自立更生，要留学，创业，娶老婆，自己想办法，自己要留多一点钱，不要为了小孩子而活我们都老得太快却聪明得太迟，我的学长去年丧妻。这突如其来的事故，实在叫人难以接受，但是死亡的到来不总是如此。学长说他太太最希望他能送鲜花给他，但是他觉得太浪费，总推说等到下次再买，结果却是在她死后，用鲜花布置她的灵堂。这不是太蠢愚了吗？！等到......、等到.....，似乎我们所有的生命，都用在等待。人生太短，聪明太晚(3)

「等到我大学毕业以后，我就会如何如何」我们对自己说「等到我买房子以后！」「等我最小的孩子结婚之后！」「等我把这笔生意谈成之后！」「等到我死了以后」人人都很愿意牺牲当下，去换取未知的等待；牺牲今生今世的辛苦钱，去购买后世的安逸在台湾只要往有山的道路上走一走，就随处都可看到「农舍」变「精舍」，山坡地变灵塔，无非也是为了等到死后，能图个保障，不必再受苦。许多人认为必须等到某时或某事完成之后再采取行动。明天我就开始运动，明天我就会对他好一点，下星期我们就找时间出去走走；退休后，我们就要好好享受一下。人生太短，聪明太晚(4)

然而，生活总是一直变动，环境总是不可预知，现实生活中，各种突发状况总是层出不穷。身为一个医生，我所见过的死人，比一般人要来得多。这些人早上醒来时，原本预期过的是另一个平凡无奇的日子，没想到一个意料之外的事；交通意外、脑溢血、心脏病发作等等。剎那间生命的巨轮倾覆离轨，突然闯进一片黑暗之中。那么我们要如何面对生命呢？我们毋需等到生活完美无瑕，也毋需等到一切都平稳，想做什么，现在就可以开始做起。

一个人永远也无法预料未来，所以不要延缓想过的生活，不要吝于表达心中的话，

因为生命只在一瞬间。人生太短，聪明太晚(5)

记住！给活人送一朵鲜花，强过给死人送贵重的花圈，每个人的生命都有尽头，许多人经常在生命即将结束时，才发现自己还有很多事没有做，有许多话来不及说，这实在是人生最大的遗憾。别让自己徒留「为时已晚」的空余恨。逝者不可追，来者犹未卜，最珍贵、最需要实时掌握的「当下」，往往在这两者蹉跎间，转眼错失。人生太短，聪明太晚(6)

人生短暂飘忽，包得有一首小诗这样写：高天与原地，悠悠人生路；行行向何方，转眼即长暮。正是道尽了人生如寄，转眼即逝的惶恐。有许多事，在你还不懂得珍惜之前已成旧事；有许多人，在你还来不及用心之前

已成旧人。

遗憾的事一再发生，但过后再追悔「早知道如何如何」是没有用的，「那时候」已经过去，你追念的人也已走过了你。人生太短，聪明太晚(7)

一句瑞典格言说：「我们老得太快，却聪明得太迟。」不管你是否察觉，生命都一直在前进。人生并未售来回票，失去的便永远不再得到。将希望寄予「等到方便的时间才享受」人生太短，聪明太晚(8)

我们不知失去了多少可能的幸福不要再等待有一天你「可以松口气」，或是「麻烦都过去了」。生命中大部分的美好事物都是短暂易逝的，享受它们、品尝它们，

善待你周围的每一个人，别把时间浪费在等待所有难题的「完满结局」上。­找回迷失的生命­死亡也许是免费的─但是，却要付出生命的代价。­劝大家一句话：把握当下，莫等待。成功人生的十堂课

人生成功第1课

做一个终生学习的人，离开学校并不意味着学习就结束了。

学习可以成为一种生活方式，帮助你发挥最大的潜能。

我们从未停止学习，总会有新的，有趣的东西等待我们去发现。

学习新的技能可能让人感到有一点恐惧，但每当我们在个人学习上停滞不前时，我们都需要去学习新的东西。

积极地寻求支援和建议，突破停滞期。

【大学课件】出品

版权归原作者所有!参加一些培训，进修，夜校－任何新的兴趣都将会有助于发展你的优势。

多看，多听，让你的头脑保持活跃。活到老，学到老。人生成功第2课

令自己感到沮丧的秘诀就是用空闲时间去烦恼自己是否快乐。所以不要费事去想它！摩拳擦掌干起来吧。你将热血沸腾，你会头脑清醒。很快，在你身体中的这种高涨的积极人生观将把烦恼从你的头脑中赶出去。

行动起来，忙碌起来。这是世界上最便宜的一种药，也是最好的一种。

人生成功第3课

在困境中寻找成功的希望

逆境是一所最好的学校。每一次失败，每一次打击，每一次损失，都蕴育着成功的萌芽，都教会我在下一次有更出色的表现。我再也不会逃避现实，也不会拒绝从以往的错误中获取经验，我不再因此而促成自己的失败。因为我知道，宝玉不经磨砺就不能发光，没有，我也不能完善自我。

现在我知道，灵魂倍受煎熬的时刻，也正是生命中最多选择与机会的时刻。任何事情的成败取决于我在寻求帮助时是抬起头还是低下头。无论何时，当我被可怕的失败击倒，在最初的阵痛过去之后，我都要想方设法将苦难变成好事。伟大的机遇就在这一刻闪现－这苦涩的根必将迎来满园芬芳！我将一直在困境中寻找成功的希望。人生成功第4课

没有人可以使你感到自卑

我选择自我感觉良好，这样我能更加开放地学习。如果人们给我负面的回应或是批评我做的事情，我不会认为他们所说的就表明我是一个“差劲的”人。我坚信自尊由我掌控，这让我毫无戒心地去听取别人的反馈，想看看是否有我可以学习的东西。

我们每天都有两种选择。我们可以感到自己很棒，也可以感到自己很差劲。难道有人会选择后者吗？

人生成功第5课

紧紧抓住梦想

我们每个人都有梦想。我们每个人都希望能发自内心地相信自已有一种特殊的天赋，相信自己能发挥重要的作用，相信自己能以一种特殊的方式感动他人，相信自己能够把世界变得更加美好。

在一生中，我们都曾经对自己渴望并追求的生活品质抱有憧憬。然而，对我们大多数人来说，这些憧憬在日常生活的成规和挫败中已经变得如此渺茫，以到于我们甚至不再努力去实现它们。对太多人来说，梦想已经远离，随之远离的还有塑造我们命运的意愿。很多人已经推动了坚定的信念，而正是坚定的信念为胜利者创造了优势。

我们所要做的就是重拴梦想，并实现梦想，让我们每个人都记住，并去运用深藏在自己身上的无限潜能。

人生成功第6课

毅力无法替代

世界上没有任何东西可以替代毅力。才干不可以，无所作为的能人十分普遍；天分不可以，碌碌无为的天才尽人皆知;教育不可以，受过良好教育的没落者更是随处可见。只要有毅力和决心，就是无所不能的。

毅力并不总是意味着永远坚持做同一件事。它意味着无论你做任何事情，你都要立刻全心投入，竭尽全力；它意味着先做艰苦的工作，再去期待随之而来的满足和回报。它意味着开心地工作，渴望更多的知识和进步。它意味着多打几个，多夏装几里路，多除草，早起床，意味着总是寻求更好的方式去做你在做的事情。毅力就是经历考验和过失的成功。人生成功第7课

驻足片刻闻花香

在现代生活的忙忙碌碌中，人们很少会停下来欣赏自然的美。

问问自己，你有多少次倾听过鸟儿的歌唱。你最近一次抬头仰望闪耀的星空又是在什么时候？

时光飞逝，人生苦短。不要忘记驻足闻闻花香。我们在急于谋生的过程中，往往忽视了我们生活的品质。多少次，你听见人们为这为那说“我忙死了。”多可惜啊！有一天，当他们真的找到时间能够驻足片刻闻花香时，可能已经太迟了。人生成功第8课

加入到微笑者和赞美者的行列来

当你对别人，别人也会对你报以，你自然会感觉很棒。即使他有对你报以，你也会感觉很棒，因为你认识到世界上最贫穷的人就是从不微笑的人，当你对那个人微笑，你立刻变得更加富有。

赞美也是这个道理。当你真诚地毛病抑或恭维一个人时，他将立刻受益，更喜欢自己。当你让别人感觉更好时，你自己也会感觉更好。

人生成功第9课让自己快乐。

调查表明，我们当中70%的人在生活中时间有临床性的抑郁现象。

如今我们有这么多的机遇，为什么我们还这么不快乐呢？

人们尝试各种东西：金钱，权利，事业，婚姻，离婚，酒精，摇滚甚至毒品，但我们大多数人只是想要得到一样东西－快乐。

快乐是人的一种自然的身心状态；我们只要去相信快乐，让自己感受快乐。

要宣称：我应当得到快乐。说出来，唱出来，喊出来。

优先考虑快乐，让快乐成为你最重要的事情。

对你所拥有的一切抱以感激之情吧。人生成功第10课我拥有无与伦比的想象力

现在我将通过这种神奇的力量得到我想要的。如果我害怕发表演讲，我就想象自己在公众场合无所畏惧，充满信心；如果我在病魔的煎熬，我就想象我以前健康的样子；如果我感到贫穷，我就想象我将要富有。

现在我明白了：人类惟一的限制就是想象力。我之所以没有成功，原因就在于我不知道如何使用我的想象力。现在，我精通这个技巧，我将从中受益。最大的回报将是成功和愈加快乐。你会管理时间吗?

如何让自己一天的时间不止24小时呢?这里有一些总结:你会管理时间吗?

（1）1.对目标、任务、会议等事件分别按优先级进行排序；2.从优先级最高的事物着手；3.和拖延做斗争，如果事情重要，从现在开始做；4.把大的、艰难的任务细分为小的、容易的部分；5.为自己创造一小时的宁静，哪怕这需要很强的意志力，或者有时不起作用；你会管理时间吗?

（2）6.找到一个隐蔽的地方，如图书馆或空闲的办公室；7.当你有重要的事情要处理时，学会对别人说“不”；8.学会委派别人做事；9.归纳相似的事情，把它们放在一起处理；10.减少例行事务：它们不值得花费过多时间。缩短低价值的事件。抛开没有价值的信件和文书工作。委派别人完成、减少或推迟优先级很低的任务；你会管理时间吗?

（3）11.避免完美主义。记住80/20定律；12.避免做出过多许诺。对你在有限时间内能完成的工作持现实态度；13.不要把时间表排得满满的，为自己留下一定机动时间应付突发事件；14.设置时间限制。例如，做某些决定时，不应超过3分钟；15.聚精会神地做手头的事情；你会管理时间吗?

（4）16.处理重要事情时，使用大块的时间；17.迅速处理困难的事情，等待和拖延不会使它们变容易；18.文书工作争取只处理一次；19.在行动以前，彻底地思索整件工作；20.第一次就做好。成功是一种习惯，习惯是需要培养的

成功是一种习惯，习惯是需要培养的（1）

1：找方法，不找借口。2：遇到挫折时，对自己说“太棒了”。3：不说消极的话，不落入消极的情绪，一旦出现立即正面处理。4：随时用零碎时间做零碎的事。5：写下来，不要太依靠脑袋记忆。6：随时记录灵感。7：守时8：把重要的观念方法写下来，并随时提醒自己。9：走路时，比平时快30%，肢体语言要健康，有力，不懒惰，不萎靡。10：每天自我反省一次。11：每天坚持一次运动。12：开会坐在前排。13：微笑。14：说话时，声音有力。15：说话之前，先考虑对方的感受16：每天有意识或真诚地赞美别人3次17:不要用训斥指责的口吻跟别人说话.18:每天做一件分外事.19:节俭.20:恪守诚信,说到做到.成功是一种习惯，习惯是需要培养的（2）“好的习惯让人立于不败之地，坏的习惯则让人从成功的宝座上跌下来”。拿破仑希尔认为，

如侵权，请告知，吾即删！

联系QQ：910670854保罗·盖蒂的这句话很有道理。有一段时期，盖蒂抽烟抽得很凶。一天，他去法国度假的途中，在一个小旅馆投宿。晚上下起了大雨，地面特别泥泞，开了好几个钟头的车之后，盖蒂实在是累极了。吃过晚饭，他就回到自己的房间里，睡着了。但是清晨时分盖蒂突然醒了过来，他很想抽支烟，于是他就打开了灯，很自然的伸手去摸他一般都会放在床头的烟，但是没有。他下了床，到衣服的口袋里去找，也没有。于是他又在行李袋里找，结果他又一次失望了。他知道这个时候旅馆的酒吧和餐厅早就关门了。他想，这个时候把不耐烦的门房叫过来，实在是不可能。现在他唯一能得到香烟的方法就是穿好衣服，到火车站去，但是那还在6条街之外呢。成功是一种习惯，习惯是需要培养的（3）看来情形并不乐观，外面还下着雨。他的汽车也停在离旅馆还有一段距离的车房里。而且，在他住店的时候，别人也提醒过他了。车房的门是午夜关，第二天早上6点才开门，现在能叫到出租车的机率也相当于零。显然，要是他真的迫切地需要一支烟，那么他只能在雨里走到黑暗中。抽烟的欲望不断地折磨着他。于是，他下了床，脱下睡衣，穿好衣服，准备出去。正在他伸手拿雨衣的时候，他突然笑了起来，笑自己傻。他突然觉得，自己的行为多荒唐可笑。盖蒂站在那里，心里不停地想着，一个所谓的知识分子，一个商人，一个认为自己有足够的智慧可以对别人下命令的人，居然在三更半夜要离开舒适的旅馆，冒着大雨走上好几条街去买香烟。盖蒂也是生平第一次注意到，他现在早就养成了一个坏习惯，那就是为了一个不好的习惯，他可以放弃极大的舒适。看来，这个习惯对他并没有什么好处，于是，他的头脑立刻就清醒了过来，很快他就做出了决定。成功是一种习惯，习惯是需要培养的（4）他已经决定好了，就走到桌子旁边把那个烟盒团起来扔出去，然后重新换上睡衣，回到舒服的床上。心里怀着一种解脱，甚至是一种胜利的感觉，很满足地关上灯，合上了眼睛。在窗外的雨声里，他进入了一个从来没有过的深沉的睡眠。自从那个晚上之后，他再也没抽过一根烟，也再没有想过要抽烟。盖蒂说，他并不是想用这件事来指责那些有抽烟习惯的人。但是他经常回忆那天晚上的情形，他只是为了表示，按照他当时的情况，他差点被一种恶习俘虏。经常做一件事就会形成习惯，而习惯的力量是难以抗拒的。但是人类还有一种潜藏的缓冲能力，也不容小觑。既然人有可能养成一种习惯，那肯定他也有能力改掉这种习惯。还有些人说，奇怪的是，养成好习惯很难，但是一个坏习惯却在不知不觉中就已经形成了。但是，事实并非如此，这还要看一个人的毅力。不管怎么说，习惯终归是习惯，并没有合理的理论说坏习惯要比好习惯更容易养成。成功是一种习惯，习惯是需要培养的（5）动作敏捷或迟缓只是个时间的问题，一个人要么习惯了准时，要么他就会习惯迟到。一个准时的人，总会体会到这种习惯给他带来的好处，无论是约会，会议，还是什么别的方面的承诺。如果别人请你吃饭，你迟到了，那就会给主人和其他的客人造成不便。你可能会因此而变得很不受欢迎，以后人家都不会再请你吃饭了。拿破仑希尔认为，对商人来说，准时是一项特别宝贵的资产。俗话说得好，“时间就是金钱”，这句话永远是正确的，现在这个时代里，这个原则比以前更加重要。现代企业的步调是一日千里，分秒必争。主管和高级职员的每日安排都是满满的，因为他们可没有多余的时间可以浪费，就像生产线不能耽搁一样。守信对生意人来说，是个难得的品德，最有希望成功的商人和公司，他们一定是准时接受定单，准时回复并交货，提供服务，准时付款，准时还债。如果等时间已过去了，订货还没到，那顾客下次可能就不找你了。成功是一种习惯，习惯是需要培养的（6）节俭是另外一种可以养成的习惯，对天生节俭的人来说，这个习惯给他带来的成功的机会要比别人多。而习惯了节俭的人，他只知道在乎时就要注意节减开支和成本。受用一生的教诲：职场10只魔戒N条箴言

第１只魔戒第一条箴言：习惯仿佛像一根缆绳，我们每天给它缠上一股新索，要不了多久，它就会变得牢不可破。第二条箴言：人类所有优点都要变成习惯才有价值，即使"爱"这样一个永恒的主题，你也必须通过不断的修炼，变成你的习惯，才真正会化为你的行动。第三条箴言：很多好的观念、原则，我们"知道"是一回事，但知道了是否能"做到"是另一码事。这中间必须架起一座桥，这桥便是习惯。第四条箴言：科学家研究发现，一个习惯的养成需要２１天的时间，这２１天是个平均数，但习惯一旦养成就将终生受用。第五条箴言：任何一个习惯的培养都不会是轻而易举的，因此一定要遵循循序渐进、由浅入深、由近及远、由渐变到突变的原则。第２只魔戒第一条箴言：人生来是简单的，和文明打交道之后变得复杂了，陷入了某种复杂的旋涡中无法自拔，这些羁绊使人忘记人性的最终追求是平静、简单、自由。

第二条箴言：不经过复杂的简单是一种苍白，我曾经很人为地把金钱放在一边它却不安分，但今天当我驾驭了金钱，它就能很安分地呆在一边。第三条箴言：要锻炼一个人的财商，让他具有富人心态，首先他确实要学会放弃，同时也要学会克服，要学会走出很多障碍和阴影。第四条箴言：财商教育的根本目的是让人们获得自由，增加收入、减少财务问题的初衷是减少人们在金钱上的虚荣心和攀比风。第五条箴言：财商教育要解决人类面对金钱的两大问题：恐惧与贪婪。而为了生活稳定这个假象，人们常常沦为金钱的奴隶。第六条箴言：对于金钱，不是说你要成为它的主人，而是要做到与之和谐、平等，因为它反映的是你自己，所以对它要多一分宽容。第３只魔戒第一条箴言：成功的实质就是获得自由度，就是当你想当的人，做你想做的事，去你想去的地方，说你想说的话。第二条箴言：世上没有懒惰的人，只有没有目标的人。世界上最贫穷的人就是没有目标的人，因为连"梦想"都没有，还会拥有什么？第三条箴言：只有明确而具体的目标才可衡量，而只有可衡量的目标才可能达到。第四条箴言：付出就表示富有，索取就是贫穷，快行动起来，用行动表现你的"富有"。第五条箴言：心态、目标、时间管理三者的集中点就是在行动上，三者的表现特征也是"行动"。它们共同形成"知行合一"的统一体。第４只魔戒第一条箴言：人的一生就是不断地闯入一个又一个圈子并不断争取承认的过程。第二条箴言：在西方社会，特别是在北美，只有那些树立自我推销和成功意识的人，才有可能赢得机会与成功。第三条箴言：国际化人才不是一个地理意义上的概念，而是文化、心理层面的概念。是否是国际化人才取决于一个人的涵养、知识构成和思维模式。第四条箴言：创业的失败率是非常高的，在美国，每年有几十万人开公司，每年也有几十万家公司倒闭，所以创业只适合一部分人。第五条箴言：我时常摸着跳动的心口，数着那一下一下的脉搏，计算着我的生命长河究竟能卷起多少浪花。我要让短暂的生命，爆发出火花。第六条箴言：命运不是机遇，而是一种选择。命运从来都不是一种可以等到的东西，而是一件需要去完成的事情。第５只魔戒第一条箴言：不管你对成功如何定义，积极总是有价值的。积极不一定成功，但消极肯定失败。第二条箴言：成功学的最大的特征就是强调标准化和量化，把认为说不清楚、不可琢磨的东西都变成可琢磨、可操作的东西。第三条箴言：成功绝对有捷径，当然它的捷径绝对不是整个过程，这个捷径告诉我们的是必须按照最有效的成功策略去做，否则你就会越忙越出错。第四条箴言：人的改变会遵循一定的轨迹，即：结果决定于行为，行为决定于态度，态度决定于信念，信念决定于自我期望。第五条箴言：人对环境有四种反应：第一是离开环境；第二是改变环境；第三是适应环境；第四是抱怨环境。前三种反应都有可能从中找到新的生机，只是千万不要选择第四种反应。第六条箴言：成功的秘诀第一个是坚持到底，永不放弃；第二个就是当你想放弃的时候，再照着第一个秘诀去做：坚持到底，永不放弃。第６只魔戒

第一条箴言：人们总是感到自己是对的，别人和世界都是不对的；所以人们总想改变世界、改变别人，很少想到改变自己。其实，改变世界应该先从改变自己开始。第二条箴言：不少老板都恨不得把员工改造成跟自己一样的人，其实最不像你的人、你最不喜欢的人，或许正是你的团队最需要的人。第三条箴言：性格本身并没有好坏之分，也没有谁对谁错。乐观和悲观对这个世界都有贡献，前者发明了飞机，后者发明了降落伞。第四条箴言：这是一个充斥着个性的时代，这是一个峥嵘着个性的社会，许多个性相差甚远的人都在适于自己的路上找到了自己最好的归宿。第五条箴言：个性是半个生命，丧失个性就是半个死亡。第７只魔戒第一条箴言：中国人的问题是更重视历史，但缺少前瞻性的思维。其实我们更应该具有未来决定现在这样一种思考。第二条箴言：如果中国只变成一个世界工厂是不行的，我们的最大优势是人，但现在还只是重视数量而没重视质量。第三条箴言：社会认可是动态的，历史上有很多人就是生前不被社会认可的，像梵高的画，像马克思的思想。第四条箴言：个性化发展强调的是你自己的个性，是适合自己的途径，我切身的体会不是学识上的成长，而是精神上的成长。第五条箴言：科技发展的日新月异、信息的爆炸，使本领的地位比任何时代都高，本领恐慌比任何时代都更可怕。第六条箴言：在２１世纪，拥有创造性学习能力是最根本的应变之道。第８只魔戒第一条箴言：在生活中所极力追求的，应该是按自己内心深处确认的人类的永恒价值，而不是流行的市场价值。第二条箴言：人的智慧力、道德力和意志力，是重要的“人格三要素”。这三种力量越强的人，越容易达到自我实现的最高境界。第三条箴言：高峰体验既是一种最佳状态，又是一种终极体验。经历了这种高峰体验的人，也就会产生这辈子没有白活的感觉。第四条箴言：物质需要属于匮乏性需要，它的满足引起的感觉是短暂的、肤浅的；自我实现需要是成长性需要，它的满足才会产生持久的、深刻的感觉。第五条箴言：第一流的菜汤比第二流的绘画更具有创造性。第９只魔戒第一条箴言：任何职业生涯规划都不能对未来进行非常精确的预测，但人们可以进行环境分析、个人条件分析，然后在此基础上确定自己的目标。第二条箴言：