基于核磁共振技术的代谢组学研究进展

生命科学(Xue)领域的核磁共振技术代谢组学概述基于核磁共振的代谢组学研究进展第一页，共五十五页。一、生命科学领(Ling)域的核磁共振第二页，共五十五页。磁共振成(Cheng)像(NMRI,NuclearMagneticResonanceImaging)磁共振定域谱(MRS,MagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振波谱(NMR,NuclearMagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振第三页，共五十五页。二、代谢(Xie)组学概述第四页，共五十五页。JeremyKNicholsonImperialCollegeLondon，UK代(Dai)谢组学的定义Metabonomics:

thequantitativemeasurementof

themulti-parametricmetabolicresponseoflivingsystems

topathophysiologicalstimuliorgeneticmodifications对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定。J.K.Nicholson,J.C.Lindon,E.Holmes.Xenobiotica,1999,29:1181-89.技术：NMR动物代谢分析：动物的体液和组织第五页，共五十五页。OliverFiehnUniversityofCaliforniaHealthSciencesDriveDavis,USAMetabolomics:

comprehensiveanalysisofallthemetabolitesofanorganism.Thequantitativemeasurementofalllowmolecularweightmetabolitesinanorganism’scellsataspecifictimeunderspecificenvironmentalconditions.生物体所有代谢物的(De)系统分析。本质是“给定细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物的(De)定量分析”。

O.Fiehn.PlantMol.Biol.,2002,48:155–171.技术：GC-MS植物代谢分析：细胞第六页，共五十五页。代(Dai)谢组学的发展198219831984198919992000200120022004Sadler,BuckinghamandNicholson:

Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:

Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:

DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:

PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAntti:

ExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublicationsVanDeGreef:

publicationofMSforurineprofiling19701997Oliver:DefinitionofMetabolomeHorming,etal.:

Metabolicprofilesofmetabolitesinhuman第七页，共五十五页。代谢(Xie)组学的中心任务对生物体液和组织中内源性代谢物质进行系统测量和分析。对生物体在受到病理生理上的刺激以及某种基因修饰所带来的代谢物的动态变化进行量化和编录，从而得到生物体代谢随时间及生化过程的变化而改变的信息。将这些信息与病生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定此变化规律相关的靶器官和作用部位，进而确定相关的生物标志物。第八页，共五十五页。系(Xi)统生物学(SystemsBiology)的组成表现型(phenotype)个体(individual)器官(organ)组织(tissue)细胞(cell)代谢物(metabolite)蛋白质(protein)mRNADNA代谢组(metabonome/metabolome)蛋白质组(proteome)转录组(transcriptome)基因组(genome)代谢组学(metabonomics/metabolomics)蛋白质组学(proteomics)转录组学(transcriptomics)基因组学(genomics)系统生物学(SystemsBiology)第九页，共五十五页。不同组学关系及分析(Xi)技术NMR,GC&MSGene第十页，共五十五页。MetabolomicsisMoreTimeSensitiveThanOther“Omics”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTime第十一页，共五十五页。GenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTargetmaterialGene,chromosome(geneticcode)mRNA(geneticcode)Protein(functionoftheprotein)LowmolecularweightmetabolitesMW100,000-120,000100,000-120,0005,000-20,000100-5000CharacteristicsContextindependentContextdependentContextdependentContextdependentAnalysisMapping,sequencingSequencingSeparation,characterizationSeparation,characterizationMethodsDNAsequencerHybridization2Dgel,MaldiTOFNMR,MS,GC,LCHuman30,000genome>109?~2,500各种组(Zu)学技术的比较第十二页，共五十五页。代谢组学分析(Xi)检测技术UPLC,HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMRspectroscopyX-raycrystallographyGC-MSLIFdetection第十三页，共五十五页。♥简便：样品不需复杂预处理，检测不需严格分析条件，避免引入干扰物的可能。♥快捷：常规1HNMR谱只需几分钟，且对低分子量和高分子量的代谢物均能给出定性和半定量的信息。♥避免漏检：不需预先选定化合物，在对待测物知识非常有限(Xian)的情况下意义尤为重要。基于NMR的代谢组学的特点第十四页，共五十五页。♥不破坏样品的原有组成：NMR方法具有无损伤性,可以在生理条件下对样品进行实时检测且不影响混合物的生理生化性质甚至化学平衡，以达到模拟体内条件和进行分子水(Shui)平的分析需要。♥NMR方法可以进行实时和动态的检测。基于NMR的代谢组学的特点第十五页，共五十五页。♥

分析组织的高分辨魔角旋转(HR-MAS)NMR方法：消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极－偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR

相媲美的分辨率。♥无偏向性:NMR对所有化合物的灵敏度是一样的,氢谱中谱峰和化合物的氢原子是一一对应的,所测的每个氢原子都有其(Qi)相关的谱峰,并且信号的强弱反映样品中各组分的相对含量。基于NMR的代谢组学的特点第十六页，共五十五页。♥多参数：从核磁谱图中的多种参数得出结构(Gou)信息。对于药物代谢来说，可以通过化学位移、谱峰的多重性、偶合常数、弛豫时间、NOE效应、谱峰强度等多种参数对同一问题做全面的反映。♥多核与多维NMR：解决同一问题可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La等）和多维（2DCOSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多种核磁共振编辑手段和实验方法。基于NMR的代谢组学的特点第十七页，共五十五页。♥检测灵敏度低(Di)：500MHz谱仪的1HNMR的检测限理论为10μM。♥水峰过强：体液中的生物分子一般其浓度为毫摩尔级，水中质子浓度约为100mol/L，是生物分子浓度的105

倍!♥检测动态范围有限：很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。♥谱峰重叠及谱线较宽。NMR检测生物样品中存在的问题第十八页，共五十五页。代谢组学中主流技术(Shu)的比较ChromatographyMassSpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiaseddetection(Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecularinformationPoorFairRichSamplepreparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledgerequirementsYesYesNoinvivo/insituImpossibleAlmostimpossibleYesThroughputFairHighHighRecurrentexpenditureHighHighLowLabourintensivenessFairFairLowCostpersampleFair/lowFairLow第十九页，共五十五页。AnalyticalApproachesBio-systemsExogenousEndogenousExposureassessmentBio-monitoringDiseasediagnosticsTimecourseDoseresponseToxins,DrugsEnvironmentaletcMetabolicpathwaysDatabasesMol.Biosyst.2009,5:288;J.Proteome.Res.2009,8:5657;2009,8:352.代谢组学方法和流(Liu)程第二十页，共五十五页。三、基于NMR的代谢(Xie)组学研究进展第二十一页，共五十五页。

在药物毒理代谢组学的研究领域，最为瞩目的工作是国际COMET(ConsortiumforMetabonomicToxicology)计划，旨在建立代谢组数据库，并为目标器官及其位点的毒性建立预测性专家系统。他们已经建立起了第一个基于机器学习的实验室啮(Nie)齿动物肝脏和肾脏毒性预测的专家系统。1.毒理研究第二十二页，共五十五页。

肾毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸铀酰、苯酚、对氨(An)基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、顺铂、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亚胺(PI)等

肝毒素：肼、异硫氢酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羟丁基甲苯(BHT)

第二十三页，共五十五页。例1.各种肾毒素对大鼠尿液1HNMR谱的影响。

A,对照组；B，20mg/kgNa2CrO4(肾脏近曲小管毒)组；C，50mg/kg对氨基苯酚(肾脏近直小管毒)组；D，50mg/kg丙烯亚胺(令肾髓质坏(Huai)死)组；E，250mg/kg2-溴乙胺(产生急性肾乳头坏死)组。第二十四页，共五十五页。-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite(ANIT)p-Aminophenol(PAP)Control第二十五页，共五十五页。尿中乳酸升高：急性肾小管受损TMAO、DMA、DMG和(He)琥珀酸水平升高：肾乳头受损氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受损氨基酸，乳酸（尿中）升高：肾小管损坏尿中琥珀酸升高，α-酮戊二酸升高，柠檬酸降低：肾小管酸中毒或线粒体酶活性降低牛磺酸升高：肝脏受损酮体含量升高：线粒体中酶代谢紊乱肌酸含量升高：睾丸毒一些重要的NMRmarkers第二十六页，共五十五页。

基于NMR的代谢(Xie)组学方法不仅能区分组织器官的正常与非正常的状态，而且能给出毒性作用的靶器官以及作用机制，识别出毒性的生物标记物。第二十七页，共五十五页。2.药物(Wu)代谢及安全性评价药物种类：利尿剂（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、苄基青霉素、先锋霉素、氟氯西林、青霉素），中枢神经药（脱氧麻黄碱），抗炎解热镇痛药（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退热净、扑热息痛），抗滴虫药（灭滴灵），治关节炎药（青霉胺），抗癌药物（[Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2]Cl、IF、CarboplationPt(II)(NH3)2

）样本：鼠尿，鼠胆汁，人尿，人淋巴液，血浆方法：1HNMR,13C,19FNMR,31P,1H-1HCOSY,1H-19FCOSY第二十八页，共五十五页。♣在药物开发阶段，代谢组学不仅可以进行早期活体毒理测试，而且能为(Wei)药物分子的筛选提供依据；♣在药物临床应用前，它能帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型；♣评价将动物模型实验应用于人类疾病的可行性。第二十九页，共五十五页。3.病理诊断(Duan)及病理生理学

代谢组学相对于基因组学研究来说，在疾病（如癌症，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）领域是一个相对较新，不断获得更加广泛认可的分析方法。利用代谢组学的方法可以实现对疾病的诊断，通过对生物标记物的寻找和相关代谢网络的研究，探寻生物标记物的代谢途径和疾病的产生机理，实现对疾病的诊断。第三十页，共五十五页。1957年，“NMR医学研究系”1979年，利用体液的氢谱对癌症进行诊断

1986年，利用人血浆中脂蛋白峰的甲基和亚(Ya)甲基的线宽区别进行恶性肿瘤的诊断近年来，通过对血浆、血清、脑脊液、卵巢囊液、组织液、鼠肝提取液的NMR分析，对体液NMR技术进行癌症或一些特异的肿瘤如：子房瘤、卵巢瘤、脑瘤、肝脏淋巴瘤、中枢神经系统恶性胶质瘤进行检测诊断的可能性进行了研究。第三十一页，共五十五页。临床和生化研究的一个重要领域：利用高分辨NMR技术研究慢性肾功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)者的生化异常。利用NMR技术可以研究先天性代谢失常，包括2-羟基戊二酸尿症、棕色糖尿病、酪氨酸血症、先天性血色沉着病、先天性尿道钙结石，在其它疾病如脑白质病、糖尿病、神经病等(Deng)方面也取得了一些有益的研究成果。第三十二页，共五十五页。例1.Urinesamples–Cataract（白(Bai)内障）Cataract(48)Control(48)第三十三页，共五十五页。例(Li)2.Serumsamples-cardiovasculardisease(冠心病)BrindleJTetal.,2002.NatMed.8(12),1439-45.第三十四页，共五十五页。4.

食品安全及质(Zhi)量控制目前对饮食的安全可靠性和食品的质量控制引起了科学领域和公众的特别关注，促进了在食品领域的代谢组学分析和对其质量控制方面的研究。第三十五页，共五十五页。

目前主要研究方向：酒精饮料和酿造食品（啤酒、葡萄酒、蒸馏酒、酱油、醋），咖啡和茶类，水果和蔬菜（果汁、柑橘、猕猴桃、芒果、黑树(Shu)莓、甜瓜、西瓜、西红柿、莴苣、芸苔、土豆、胡萝卜、玉米、小麦），橄榄油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黄油和人造黄油），蜂蜜，鱼和肉类。还有其它的研究如松露、菌类和藏红花。第三十六页，共五十五页。PCA(A)andOPLS-DA(B)3Dscoreplotsderivedfromthe1HNMRspectraofbeefsirloin(orchuck)extractsobtainedfromAustralia,Korea,NewZealand,andtheUnitedStatesofAmerica.例1.Extractsfrombeefsirloin(牛里(Li)脊肉)第三十七页，共五十五页。例(Li)2.Beer（啤酒）Thesamecompany,protocol(Genome),pipe-line(Proteome),butdifferenttaste(Metabolome)第三十八页，共五十五页。例3.Wine（葡萄(Tao)酒）RedwineMoretanninsandphenolicsWhitewineMoreaminoacid第三十九页，共五十五页。例4.蜂(Feng)蜜（Honey）CJ(Chinesejujube，枣花),LJ(Lonicerajaponica，金银花),FS(Flossophorae，槐花),FCI(Floschrysanthemiindici，菊花),EJ(Eriobotryajaponica，枇杷)不同花蜜的NMR谱第四十页，共五十五页。例(Li)4.蜂蜜（Honey）相同产地不同花源相同花源不同产地相同厂家不同批次第四十一页，共五十五页。5.营养代谢研究

代谢组学的方法可以帮助识别和常量营养物的最终摄入效应密切相(Xiang)关的代谢物，并且有助于定义各种常量营养物的正常摄入范围。营养代谢组学（Nutrimetabolomics）定义的提出。第四十二页，共五十五页。

饮食与营养科学与代谢组学相结合系统地表征在不同健康状态（健康，亚健康，疾病）下，饮食习惯，地域差异，营养结构（种类和用量），营养相关疾病等对机体造成的细微代谢变化，这些变化概况(Kuang)为探索不同饮食或营养条件下机体内的细胞，组织和器官的生物标记物，代谢整体水平以及代谢作用机制，并有可能为机体的健康状况(Kuang)动态地况(Kuang)进行诊断和营养搭配提供新的策略。第四十三页，共五十五页。6.功能基因组的研究

随着人类基因组测序工作的完成，人们已(Yi)经步入到了后基因组时代即对功能基因组学的研究。通常，功能基因组学利用基因组提供的信息和产物，运用遗传或其他新的实验技术，通过识别基因在一个或多个生物模型中的作用来全面认识和分析基因的功能。第四十四页，共五十五页。

基因产生变异的生物体在生长速率等表型上可能没有显著的改变，这是因为细胞内的代谢物浓度的改变补偿了变异产生的影响。但是这也同时意味着生物体在代谢表型上可能会有显著的变化。代谢组学作为功能基因组学研究应用的一个重要方法，主要是从基因表达谱的终点——代谢物组的信息来鉴定或推测出基因的功能。“基因组学告诉我们什么可能发生，代谢组学则告诉我们发生了什么”，二者相(Xiang)互关联，将会从现象到本质探寻生命的奥秘。第四十五页，共五十五页。7.中医药现代化

代谢组学有可能在中医“病、证、方”的研究体系中发挥作用，在规范中医基于证的诊断标准、探索证候的动态内涵和演变规律，以及提示证与疾病疗效的相关性和科学性方面扮演重要的角色。另外在中药质量控制、整体疗效和中药安全(Quan)性也进行了初步研究。第四十六页，共五十五页。8.微生物领域的研究

微生物代谢组学是力求在特定的条件下分析微生物体系中所有代谢物的动