卫生化学-荧光分析法

卫生化学——荧光分析法第1页/共58页2第五

章荧光分析法Fluorometry第2页/共58页3概述某些化合物在受到光辐射后，除了吸收某种波长的光之外，还会发射比原来所吸收的波长更长的光—光致发光现象光致发光荧光磷光分子荧光原子荧光荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及强度进行物质鉴定和含量分析的方法。第3页/共58页4第4页/共58页5FLU与UV-Vis的比较FLUUV-Vis光谱性质发射光谱吸收光谱被测物的性质很强的紫外-可见光吸收有紫外-可见光吸收灵敏度高，10-10～10-12g/ml一般选择性高低但在光谱分析中，荧光分析法不及紫外-可见分光光度法普遍，这主要是由于有机分子的结构所决定的—能发荧光的物质较少第5页/共58页6双嘧达莫萘普生几个常见的发荧光的药物第6页/共58页7

黄曲霉毒素结构第7页/共58页8苯并(a)芘世界公认的三大强致癌物质是黄曲霉毒素、苯并芘和亚硝胺第8页/共58页9核黄素环丙沙星第9页/共58页10第一节荧光分析法的基本原理

一）、荧光的产生

１．分子内部能量之间的关系物质对光的选择性吸收与分子内量子化的内部运动紧密相关：

E总=E电+E振+E转E电为电子运动的能级；位于紫外可见光区域E振为分子振动的能级；主要用于红外光谱分析E转为分子转动能级，很微弱，难以测到纯粹的E转一分子荧光的产生第10页/共58页11基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。三重态能级低于单重态(Hund规则)第11页/共58页122．分子的电子能级与激发过程

分子的电子能态的激发包含了电子从基态轨道跃迁到激发轨道，分子的能量随着增加。

大多数分子含有偶数个电子，处于基态时，电子成对地填在能量的最低各轨道上。根据Pauling不相容原理：一个给定轨道的两个电子，自旋方向一定相反，自旋量子数为1/2与-1/2，总自旋量子数S=0。

分子的多重性M=2S+1=1.

此种情形称为单重基态(S0)，这些分子放在磁场中，没有发生能级分裂。即基态没有净自旋。↑↓电子轨道第12页/共58页13当基态的一个电子吸收光辐射后被激发到较高的电子能态时，通常电子不发生自旋方向的改变，此时两个电子的自旋方向仍然相反，净自旋s=0，这时分子处于激发单重态(S*)。某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向相同，自旋量子数都是1/2，总自旋量子数s=1，这时分子的多重性M=2S+1=3，称为激发三重态(T*)。第13页/共58页14根据洪特规则(Hundprinciple)，处于分立轨上的非成对电子，平行自旋要比自旋成对更稳定，因此，三重态总是比相应的激发单重态具有更低的能量。3.

分子吸收辐射的特点分子吸收辐射是一种激发过程，根据波尔兹曼(Boltzmann)分布，当分子吸收了紫外-可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的各个不同振动-转动能级，不能直接跃迁到激发三重态的各个能级上。第14页/共58页15单重态和三重态的电子分布模式图A单重基态B激发单重态C激发三重态EABC不是直接的跃迁！第15页/共58页16激发单重态激发三重态磁性抗磁顺磁平均寿命10-8s10-4s-1s跃迁情况允许跃迁禁阻跃迁

能量高一些低一些

激发单重态与激发三重态的比较第16页/共58页174.

分子对所吸收到的辐射的处理根据能量最低原理：由于激发单重态的分子能量较高，因而激发态的分子是不稳定的，所以会通过辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放出多余的能量而返回到基态—去激发过程，在去激发过程中以速度最快、激发态的寿命最短的途径占优势。去极化过程无辐射跃迁辐射跃迁振动弛豫(vibrationalrelaxation)内部转换(internalconversion)外部转换(externalconversion)系间穿越(intersystemcrossing)荧光(fluorescence)磷光(phosphorescence)

第17页/共58页18分子中能级变换模式图(Jablonski)S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第18页/共58页195.

相关名词术语vibrationalrelaxation振动弛豫：处于激发态的各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分能量释放出来，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程—只能发生在同一电子能级内的不同振动能级之间internalconversion内部能量转换：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致振动能级发生重叠时，受激发分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程—容易发生

第19页/共58页20externalconversion外部能量转换：激发态的分子与溶剂分子或其它溶质分子发生碰撞而将部分能量以热能的形式释放出来—降低荧光强度intersystemcrossing体系间跨越：处于激发态的分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生改变的过程。如S1*的最低振动能级同T1*的最高振动能级重叠时，则有可能发生S1*

T1*—使荧光强度降低甚至熄灭容易发生在含有重原子分子或溶液中存在O2等顺磁性物质中。第20页/共58页21fluorescenceemission：激发单重态内部转换或振动弛豫S1*的最低振动能级发射hυ

S0的任一振动能级荧光特点：1.不是单一的过程，借助了振动弛豫和内部转换的过程

2.持续过程为10-9～10-7s3.发射出来的波长大于吸收的激发波长

4.呈现带状的光谱第21页/共58页22phosphorescenceemission：体系间跨越

S*T1*的最低振动能级振动弛豫发射hυ

S0的任一振动能级磷光特点：1.不是单一的过程，借助了振动弛豫和体系间的跨越

2.波长大于荧光的波长

3.持续过程为10-4～10s4.低温条件下才可见区别荧光和磷光？第22页/共58页23二、荧光的激发光谱和发射光谱荧光物质分子具有两个特征光谱：激发光谱(excitationspectrum)

表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。

固定发射波长，用不同波长的激发光来激发荧光物质，记录荧光强度。2.

发射光谱(emissionspectrum)—荧光光谱(fluorescencespectrum)

表示所发射的荧光中各种波长的相对强度。

固定激发波长，扫描该波长激发所引起荧光物质分子发射不同波长的相对强度。第23页/共58页24荧光光谱的性质斯托克斯位移(Stokesshift)

荧光发射波长总是大于激发波长。原因：无辐射跃迁，使能量发生了损失。300400500nmFab硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱(b)第24页/共58页252.荧光光谱的形状与激发波长无关原因：荧光光谱只有一个发射带—从S1*的最低

振动能级向基态回落过程中发射辐射。3.荧光光谱与激发光谱呈镜像关系F280360440520600nm激发光谱荧光光谱b4b3b2b1b0c1c2c3c4c0第25页/共58页26s0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4s1*V=4V=3V=2V=1V=0V=4V=3V=2V=1V=0∆E4∆E1∆E3∆E2∆E3∆E4∆E2∆E1蒽的能级跃迁第26页/共58页27二荧光与分子结构荧光寿命与荧光效率

荧光寿命(fluorescencelifetime)——当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e时所需的时间。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合组分的分析。设t=时，Ft为F0的1/e,则该公式可以表征荧光寿命。第27页/共58页28

荧光效率(fluorescenceefficiency)——指激发态分子发射荧光的光量子数与基态分子吸收激发光的光量子数之比。ψf=发射荧光的光子数吸收激发光的光子数如果荧光物质从激发态回到基态过程中没有其他去极化过程与发射荧光相竞争，那么荧光分子就可以将所吸收的辐射全部以荧光的形式发射出来。此时其荧光效率为1。第28页/共58页292.有机化合物分子结构与荧光的关系

A.强的紫外-可见光吸收

分子中含有长的共轭π键(不饱和度高)，则容易发生跃迁，且共轭性越强，荧光强度越大。B.较高的荧光效率具有刚性平面，共共平面性越强，则容易可保持较高的荧光效率。另外，一个有机物能否发荧光以及荧光的强弱还受取代基团的影响。第29页/共58页30

苯λex=205nmλem=278nm

萘λex=286nmλem=321nm

蒽λex=356nmλem=404nm第30页/共58页31联苯芴芴分子中的两个苯环不能自由旋转，为刚性分子第31页/共58页32Al3+8-羟基喹啉8-羟基喹啉铝荧光增强第32页/共58页33反-1,2-二苯乙烯顺-1,2-二苯乙烯荧光√荧光×第33页/共58页34取代基增强π电子共轭程度—使荧光波长长移NH2-,OH-,OCH3-等减弱π电子共轭程度—使荧光减弱或熄灭COOH-,NO2-,-C=O,SH-及卤素原子等不影响π键—对荧光基本没有影响如R-,SO3H-等第一类为给电子基团第二类为吸电子基团第34页/共58页353.荧光试剂

在荧光分光光度法中，常使用某些荧光试剂，使之与被分析物质发生反应，生成荧光效应强的物质—提高分析的灵敏度和选择性荧光胺能与伯氨基反应，生成的衍生物Ex=390nm,Em=480nm第35页/共58页36邻苯二甲醛常作为氨基酸含量测定的荧光反应试剂丹磺酰氯丹磺酰肼能与伯、仲胺基及酚羟基的生物碱反应，产生比较强的荧光第36页/共58页37三影响荧光强度的外部因素1.温度

T↑，荧光效率和荧光强度↓

。原因：分子间的碰撞加强，消耗了部分能量。2.溶剂

①

极性↑，荧光波长↑，且荧光强度↑。

②

黏度↑，荧光强度↑原因:①

极性溶液中，荧光分子π→π*的∆E↓

②

分子间的热碰撞几率降低那么磷光呢？第37页/共58页383.酸度

溶剂的pH值会使分子的结构发生改变，如双键位移，从而使光谱性质发生变化。想想酸碱滴定中指示剂为什么会随着pH值的改变而颜色发生变化呢？4.荧光熄灭剂(1)发生分子碰撞损失了荧光物质的能量；(2)O2分子的顺磁性，促进了体系间的跨越，诱发S1*→T1*(3)

荧光物质溶液浓度过大时(>1g/L)，产生自熄灭第38页/共58页395.散射光(1)瑞利散射光(Reileighscatteringlight)

光子与物质分子发生弹性碰撞，没有能量的交换。(2)拉曼光(Ramanscatteringlight)

光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子与物质分子间有能量的交换—干扰荧光测定

尤其是波长比入射光更长的拉曼光，因其与荧光接近，因此必须采取措施消除。选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰第39页/共58页40强度320448Ex=320nm硫酸喹宁350448强度320360Ex=320nm0.1mol/LH2SO4350400Ex=350nm硫酸喹宁Ex=350nm0.1mol/LH2SO4无干扰√有干扰×Raman光谱有何特点？第40页/共58页41第二节荧光定量的分析方法溶液中物质的荧光强度与该物质吸收光量子的程度以及荧光效率有关—成正相关关系I0FI一般在垂直方向观察或测量荧光强度溶液中荧光的测定1.荧光强度与物质浓度的关系荧光分光光度计的设计原理第41页/共58页42有关计算设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为L。荧光强度正比于被测荧光物质吸收的光强度，即：F∞(I0-I),F=K'(I0-I)

K'为常数，其值取决于荧光效率。根据Beer定律：I=I010-ECl第42页/共58页43若浓度C很小，ECl也很小，，当ECl≤0.05时上式中括号中第二项以后的各项可以忽略。得F=2.3K'I0ECl=KC因此，在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比—荧光定量分析的依据。注意：当荧光物质溶液的浓度太高时，则荧光响应值与浓度之间就偏离了线性关系。第43页/共58页442.定量方法(1)校正曲线法

以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，建立线性方程。在绘制标准曲线时，常采用系列中某一对照品浓度作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至0，将该对照品溶液的荧光强度调至100%或50%，然后测定对照品系列中其他溶液的荧光强度F。

A.每次校正的样品应采用同一对照品溶液。

B.如果对照品对光不稳定，则可以用另外一个与被测物荧光光谱相近的物质作基准来校正仪器。第44页/共58页45(2)比例法

如果标准曲线能够通过原点，则可以直接进行对比测定。如果空白溶液的F不能调至0，则按(3)联立方程式法

用于多组分混合物的荧光分析。第45页/共58页46盐酸洛美沙星200285323400

350445600

FF激发光谱荧光光谱第46页/共58页47测定法：用0.1mmol/L的盐酸配制浓度为1.5ug/mL的溶液，进行光谱扫描，得知其最大吸收波长为285nm，发射波长为485nm。同时用HCl溶液作空白对照。测得该浓度的洛美沙星的荧光值为Fs

,另按该法配制供试品溶液，同法测定荧光响应值Fx

，按照比例法公式，计算，即得供试品溶液的药物浓度。其中Cs=1.5ug/mL第47页/共58页48第三节荧光分光光度计1.荧光分光光度计由光源、激发单色器、发射单色器、样品池和检测系统组成。激发单色器样品池吸收物发射单色器检测器放大器指示器记录器Xe灯第48页/共58页492.仪器的校正

A.灵敏度：直接影响方法的检出限。一般用1ug/mL的硫酸奎宁进行检查。

B.波长

C.光谱：影响测定的灵敏度和准确度。原因：光源强度不稳定；

检测器对波长的感应不呈线性。采用双光束光路，即用一个参比光来抵消测量误差。第49页/共58页50第四节荧光分析新技术激光荧光分析(laserfluorometry)

优点：单色性好、强度大、稳定性高2.时间分辨荧光分析(time-resolvedfluorometry)

原理：利用不同物质的荧光寿命的不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。抗干扰性强，可用于复杂的多组分的分析。第50页/共58页514.同步荧光分析(synchronousfluorometry)

原理：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值∆λ

（通常为λex与λem之差)，同时扫描发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱。

Fsp(λex,λem)=KCFexFem

灵敏度很高。3.荧光免疫分析(fluoroimmunoassay)

原理：利用荧光标记的抗原与抗体之间的反应进行分析。用于生物化学、免疫学、遗传学和分子生物学中蛋白及多肽的分析。第51页/共58页525.胶束增敏荧光分析(micellarsensitizedfluorometry)

原理：利用表面活性剂(SDS)，形成胶体溶液，来减弱被分析物由于分子热运动所造成的能量损失甚至荧光熄灭现象。特点适用范围广灵敏度高稳定第52页/共58页53学习要求1、熟悉分子内部能级跃迁的模式及相关的概念2、理解荧光发射和磷光发射的过程3、理解激发光谱与荧光光谱的含义，掌握荧光光谱的特点4、熟悉荧光寿命与荧光效率的含义5、掌握影响有机物质荧光强度的因素6、掌握荧光定量分析的方法依据第53页/共58页54练习题一、选择题1.根据下列结构，那种物质的荧光效率最大

A苯B联苯C蒽D萘2.下列物质中，哪个的荧光强度最大

A.苯酚B.硝基苯C.苯甲酸D.苯甲醛第54页/共58页553.影响荧光强度因素有

A分子结构的稳定性B.分子的取代基团

C溶液的温度D.溶剂的性质E.分子量的大小4.光和物质分子发生碰撞，不发生能量的交换，仅是光子运动的方向发生改变，这种