微生物检验基本要求

微生物检验基本要求内容微生物学基本知识微生物学检验技术微生物学实验室的质量保证微生物学实验室的生物安全微生物基本知识微生物的概念微生物的种类微生物的特点微生物学的主要分支学科微生物基本知识◆

微生物的概念

是一群形体微小、结构简单的低等生物的统称。需借助光镜或显微镜测量单位为微米或纳米微生物基本知识微生物的种类§真核细胞型：(eucaryotae)

真菌（霉菌、酵母、蕈类)、藻类§原核细胞型：

(procaryotae)

细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体§

非细胞类：（nocell)

病毒、类病毒、朊病毒等微生物的相对大小可见范围肉眼光学显微镜电镜真核细胞型原核细胞型病毒◆微生物的特点体积小，面积大吸收多，转化快生长旺，繁殖快适应强，变异频分布广，种类多微生物基本知识

体积小面积大微生物的个体极其微小必须借助显微镜放大几倍、几百倍、上千倍，乃至数万倍才能看清。表示微生物大小的单位是微米（1米＝106微米）或纳米（1米＝109纳米）。如：杆菌的宽度是0.5微米，80个杆菌“肩并肩”地排列成横队，也只有一根头发丝的宽度。杆菌的长度约2微米，故1500个杆菌头尾衔接起来仅有一颗芝麻长。吸收多转化快如大肠杆菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量2000倍的糖而人要完成这样一个规模则需要40年之久生长旺繁殖快大肠杆菌(E.coli)§

37℃培养在牛奶中，12.5min即可分裂一次；一般培养液的菌浓度为108-109个/ml§如各方面的条件都合适，大肠杆菌每12.5-20（有说20-30）分钟分裂一次按20分钟来算，则1昼夜分裂72次，那么1个菌体就会产生272（即4722366500万亿）个，重达4722吨

适应强变异频耐热：在250℃-300℃的高温条件下正常生长

耐寒：多数细菌能耐0℃到－196℃的低温

耐盐：嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活

耐干：产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能保藏几十年、几百年甚至上千年

耐酸耐碱耐压:

突变频率一般为10-5-10-10

分布广种类多§在地球上几乎无处不有，无孔不入

85公里的高空、11公里深的海底、2000米深的地层、近100℃（甚至300℃）的温泉、零下250℃的环境下，均有微生物存在§微生物种类繁多

迄今为止，微生物约有10万种，估计目前已知的种只占地球上实际存在的微生物总数的20%微生物学的主要分支学科微生物学检验技术一、微生物学检验的目的

◆临床微生物检验：为诊断提供病原学依据为治疗提供参考用药的信息为医院感染提供病原微生物及其耐药性动态信息改进或更新临床微生物学检验的方法

◆

卫生微生物检验：判断水、空气、食品、日用品以及各类公共场所的卫生状况

指标性微生物

指标性微生物

指标菌可以归纳为以下三种类型：◆一般卫生状况指标菌最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌总数意义：评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性◆粪便污染指标菌主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体以及脊髓灰质炎病毒等意义：标志着检品受过人、禽畜粪便的污染，同时也可表明有肠道致病菌存在的可能指标性微生物◆致病菌（控制菌）包括某些特定环境不能检出的菌类食品、化妆品或药品等样品中规定一些不得检出的致病菌例如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、破伤风芽胞杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌等食品卫生微生物检验一般卫生状况指标菌检验

菌落总数、霉菌和酵母菌粪便污染指标菌检验

大肠菌群、类大肠菌群控制菌检验沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、产气荚膜梭菌、椰毒假单胞菌酵米面亚种、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌

化妆品卫生微生物检验一般卫生状况指标菌检验

菌落总数检测霉菌和酵母菌检测粪便污染指标菌检验粪大肠菌群检验控制菌检验绿脓杆菌检验金黄色葡萄球菌检验微生物学检验技术三、标本采集与处理不同的样品采集、保存、运送的要求都是不同的标本采集原则§无菌操作

无菌采集、采样用具、容器必须要经过灭菌处理

早期安全足量§采样前、后都应及时做好标记采集的样品要有代表性§采样后应及时将样品送到微生物检验室标本的运送标本采集后最好及时运送到实验室若不能，应储存在合适的一定环境条件

细菌:病毒:感染性样本应注意安全防护运送过程防止泄漏和破碎微生物检验技术四、微生物学检查形态学检查人工培养:接种分离纯化培养技术分离鉴定及增菌培养毒力鉴定及抗菌药物敏感试验生化试验免疫检测技术：抗原检测抗体检测核酸检测技术：核酸分子杂交PCR

动物试验

自动化技术形态学检查

直接镜检显微镜观察：光学显微镜电镜人工培养分离培养与鉴定：

革兰氏染色阴性成鱼群状排列的弧菌

霍乱弧菌接种技术分离纯化技术培养技术霍乱分离培养分离用的培养基有强、弱2种选择培养基弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离生化试验霍乱红试验

阳性霍乱弧菌氧化酶试验

粘丝试验靛基质试验免疫检测技术抗血清凝集技术乳胶凝集实验荧光抗体检测技术协同凝集试验（COA）酶联免疫测试技术微生物检验技术

霍乱检验程序分子生物学检测核酸探针杂交技术PCR技术:PCR&RT-PCRReal-timePCRQβ复制酶法连续扩增反应法（Lar）转录放大系统（TAS/3SR/NASBATM）放大信号检测法

……分子生物学技术在病原菌检测上的应用

细菌:沙门氏菌李斯特杆菌葡萄球菌假单胞菌属大肠杆菌志贺氏菌耶尔森氏菌弯曲杆菌弧菌病毒:流感&禽流感肝炎SARSNorovirusAdenovirusEnterovirusDenguevirusRinovirus……

自动化技术微生物自动鉴定商品名称分析手段

生产商AutomicrobicBiochemicaltestsBioMerieuxVitek,Hazelwood,MOBactometerConductanceBioMerieuxVitek,Hazelwood,MOATBCarbonassimilationBioMerieuxVitekHazelwood,MOVIDASAutomatedEIAcBioMerieuxVitekHazelwood,MOMISFattyacidprofileMicrobialIDNewark,DEMaalthusdConductanceRadiometerAmericaWestlake,OHSensititreFluorogenicdnzymeReactionsRadiometerAmericaWestlake,OHBiologCarbonutilizationBiologHayward,CAWalkAwayBiochemicalBaxterDiagnosticsW.Sacramento,CAAutoSCANBiochemicalBaxterDiagnosticsW.Sacramento,CAALADINBiochemicalAnalytabProductsPlainview,NYUniSceptBiochemicalAnalytabProductsPlainview,NYAutoSceptorBiochemicalBectonDickinsonCockeysville,MD微生物检验中的质量保证

及实验室管理微生物实验室质量保证的措施室内质控室间质评微生物实验室质量保证的目标

可靠性可重复性实际效果及时性过程控制文件微生物学检验过程试验过程控制样品采集样品标记样品运输培养基染料仪器样品接收和登记检验分析研究准备相关检验报告试剂熟练程度微生物检验的质量控制试验前试验中试验后正确的病人正确的取样正确的条件适当的仪器合适的试验材料正确的方法正确的资料合适的时间微生物培养基的质量控制检测所有培养基的性能自行配制：所有批次商业制备：只检测新批号培养基质量要求微生物污染生长特性生长率选择性生理生化特性选择性和特异性外观、色泽和均一性琼脂凝胶的硬度水份含量pH缓冲能力

对培养基进行质量控制的主要内容培养基的质量控制检查

pH，无菌性，支持生长的能力，培养基的选择或抑制特性(目标微生物生长，非目标微生物不生长)，生化反应，琼脂凝胶的硬度，水份含量，外观和色泽的均一性检测频率检测各个批次或各批号将结果记录在培养基质量控制表格

含人血的血平板不适于微生物检测配制培养基时的质量控制

严格按培养基配方和培养基配制操作程序进行配制

每批培养基均应有配制记录如名称、配制量（各种成分用量）、配制者、配制日期、有效期以及性能和无菌试验无菌实验:配制培养基时的质量控制性能试验培养基的储存应放在冷暗、干燥处

含有血液和其他有机添加剂抗菌素的培养基要储存在冰箱里培养基的贮存

培养基种类保存条件保存时间三角瓶（棉塞）培养基

室温一周三角瓶（螺旋盖）培养基室温三周平板培养基室温当天平板培养基（装袋密封）4℃

一周培养基使用中应避免的问题污染了的培养基已失水的培养基使用过期的培养基培养基配制记录的快速提示

实验室制备的所有培养基都必须记录：

配制日期和配制人培养名称，批号，培养基粉名称所配平板、试管、瓶的数量分装的批号颜色、一致性、外表用于质量控制的平板数量24/48小时无菌实验生长实验培养基的pH我国培养基相关标准1.YYT0557-2005营养琼脂培养基2.YYT0578-2005沙门、志贺菌属琼脂培养基3.SNT1538.1-2005培养基制定指南第一部分：实验室培养基制备质量保证通则4.SNT1538.1-2007培养基制定指南第2部分:培养基性能测试实用指南M-H琼脂板的质量控制无菌（每批平板随机选择一个样本作无菌试验，培养48-72h）厚度：4mm，且厚度必须均匀（9cm平板倾注琼脂量25-30ml；16cm平板需60ml左右）调节pH到7.2-7.4（pH过低---氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响：含过量的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的培养基可能逆转磺胺类甲氧苄氨嘧啶的抑菌效应，使抑菌圈模糊变小，甚至消失。用TMP-SMZ纸片可测定培养基中的磺胺嘧啶得含量，当抑菌圈清晰、直径≥20mm，说明该培养及合格二价阳离子含量变化的影响Ca++、Mg++：影响氨基糖苷类、四环素的抑菌圈Zn++：影响碳头孢烯类平板表面应干燥：使用前干燥平板平板有效期为5天使用含血的M-H培养基特别注意项M-H琼脂板的质量控制诊断血清的质量控制注明收到的日期，如为冻干制品，还应注明配成水溶液的日期使用前检查外观应清澈，如出现混浊则表示已被杂菌污染使用时应注意各种诊断血清的有效期和效价每月用标准菌株试验其敏感性和特异性

染色液的质量控制染色液配制后，必须用适当的标准菌株作阳性及阴性对照试验在使用期内每隔一段时间进行监测其监控频率随染色液的稳定性和使用频率而定

染液的质量控制革兰氏染料质量控制使用革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株析出晶体检测污染细菌检测定期参加能力验证进行实验室内比对

其他染料抗酸性染色真菌的KOH染色吖啶黄肠道寄生虫染色疟疾涂片染色

染料和试剂准备标签内容名称浓度制备日期使用时间过期时间/保质期制备者

质量控制菌株什么是质控菌株？在染液和培养基中有预期反应的已知菌株菌株的来源？ATCCAmericanTypeCultureCollection美国菌种保藏中心NTCC NationalTypeCultureCollection(UK)国际菌种保藏中心(英国)CIPPasteurInstituteCollection(France)巴斯德保藏中心(法国）质控菌株如何使用？确保培养基，试剂和用品有预期的效能

设置阴性和阳性对照株

质控菌株的保存储备检测所有培养基和实验系统的质控菌株

例如：大肠杆菌(ATCC#25922)–麦康凯培养基或EMB，药敏试验金黄色葡萄球菌(ATCC#25923)–血琼脂，甘露醇高盐琼脂培养基，药敏试验淋病奈瑟氏菌(ATCC#49226）–巧克力培养基，T-M培养基所需要的其他质控菌株质控菌株的使用在每批培养基及新的药敏片使用时同时做质控，标准菌株的抑菌环或MIC值在标准范围内E.coliATCC25922S.aureusATCC25923P.aeruginosaATCC27853根据抑菌环直径分析变化根据你的检测使用不同的标准株（ATCC,IP或其他）药敏试验常用质控菌株常规药敏标准菌株大肠埃希菌 ATCC25922金黄色葡萄球菌 ATCC25923铜绿假单胞菌 ATCC27853流感嗜血杆菌 ATCC49247 ATCC49766肺炎链球菌 ATCC49619β-内酰胺酶（ESBLs）测定标准菌株

肺炎克雷伯菌ATCC700603，大肠埃希菌ATCC35218培养基磺胺嘧啶测定标准菌株粪肠球菌ATCC29212仪器设备-微生物学监控温度培养箱冰箱冷冻柜 进行功能检测移液器高压锅酸度计秤重保存记录显微镜保持镜头清洁保证至少一个油镜(X100)使用转扭调节镜头非油镜不要浸入油中

移动样本时不能使样本高于镜头确保照明系统

消毒与灭菌培养基试剂材料废物灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的方法消毒(Disinfection）：杀灭病原微生物的方法两阶段灭菌控制过程控制化学指示剂生物指示剂灭菌产品控制生长实验(生物验证）灭菌指示物高压湿热灭菌指示胶带（121℃，132℃）干热灭菌指示胶带环氧乙烷灭菌指示胶带γ射线灭菌指示标签生物指示剂灭菌指示物化学指示物

仅指示灭菌温度，但不涉及灭菌时间和压力生物学指示物指示灭菌需要的温度、时间和压力注意：指示物在以下情况下不保证灭菌的效果：高压锅内东西放的过多；培养液体积过大；灭菌后的生物验证试验十分重要药敏实验为选择合适的抗生素进行治疗提供依据监测耐药趋势体外药敏实验无明显的生长有明显的生长敏感不敏感药物目标菌肉汤稀释法药敏试验中可能出现的错误培养基不好——太陈旧，厚度，pH过期或保存不当的药片——

活性降低错误的接种——

细菌接种量太多或太少错误的孵育——

温度太热/太冷，时间太长/太短错误的仪器设备——

读错区带错误的解释——

曲解区带

药敏检测

孵育条件、温度和时间肠杆菌科：35℃±2℃，空气，16-18h葡萄球菌属：33-35℃,空气，16-18h，苯唑西林和万古霉素需24h观察肠球菌属：35℃±2℃，空气，16-18h， 万古霉素需24h观察嗜血杆菌属：35℃±2℃，5%CO216-18h链球菌属：35℃±2℃，5%CO2，

20-24h药敏实验的质量控制质控菌株必须有可靠的来源

使用特定的质控菌株去检测不同的药物-目标菌组合

按照厂家的说明储存抗生素试剂

药敏试验质量控制培养基抗生素菌液培养箱菌种药片M-H培养基保存温度McFarland0.5(108bacteria/ml)温度气压 保存条件，使用要求保存条件（温度、干燥）ATCC标准株，4mm厚，pH-20oC以下分光光度计检测标准的温度计气压计标准菌株、待测菌株纸片分配器优点实用，快速

提高了可重复性

缺点增加污染的机会降低了人员判断技能等保存使用之后，放回冷藏箱，朝上放置。

操作者的熟练度常规的能力验证

室内实验程序完全按照SOP进行实验操作质量控制：免疫学-血清学针对抗原-抗体检测试验每天至少有一次试验带上阳性和阴性对照。包括弱阳性对照

所有孵箱，摇床和离心机的功能监控

质量控制：分子诊断样品采集，运输和处理保证所有上述过程中核酸的完整性

控制污染在无DNA区域，配制试剂后进入样本处理区，再进入扩增和检测区；并保持这一单向流程

阳性和阴性对照参考：感染性疾病的分子诊断方法

目的：

存活，不丢失，不污染

防止优良性状丧失

随时为生产、科研提供优良菌种

原理：

选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）

创造降低微生物代谢活动强度

生长繁殖受抑制

难以发生突变的环境条件

其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等

菌种保藏：

菌

连续在培养基上（内）移种

种

生活态

传代培养保藏法

连续在活宿主上（内）移种

保

固体斜面

藏

湿法半固体琼脂柱

方

休眠态

液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）

法

干法藏在玻璃管内

吸附在合适的载体上菌种保藏的方法干法保藏菌种的方法

滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）

薄片状载体滤纸片明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）

几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价

冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3-6月6-12月1-2年1-10年5-15年以上简便简便简便简便有效简便有效菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：

中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

美国的典型菌种保藏中心(ATCC)

英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：微生物检验与生物安全实验室安全防护感染性废弃物的处理实验室分级依据实验室分级处理对象危险等级BSL-1ABSL-1对人体和环境危害较低，不会引发健康成人疾病Ⅰ级BSL-2ABSL-2对人体和环境有中等危害或具有潜在危险的致病因子Ⅱ级BSL-3ABSL-3主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致命疾病的致病因子。通常有预防治疗措施Ⅲ级BSL-4ABSL-4对人体有高度危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明的微生物。尚无预防治疗措施Ⅳ级微生物危害程度分级

（国际分级标准）危险等级I

（低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。危险等级Ⅱ

(中等个体危害，有限群体危害)能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。微生物危害程度分级

（国际分级标准）危险等级III

（高个体危害，低群体害）能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。危险等级Ⅳ

(高个体危害，高群体危害)能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。病原生物的危险等级分布种类危害等级Ⅳ危害等级III危害等级Ⅱ危害等级I病毒185114219