第五章灭菌与除菌的知识

第四节——无菌检查与染菌的处理

2、造成发酵染菌的可能途径有哪些？1、什么叫发酵染菌?3、染菌会对发酵工业造成哪些不良影响？4、在现有科学条件下能否做到彻底不染菌？据报道，国外抗生素发酵平均染菌率为2%-5%，国内的青霉素发酵染菌率2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率1-2%。发酵过程危害最大的杂菌种类

青霉素的发酵链霉素的发酵四环素的发酵谷氨酸的发酵柠檬酸的发酵细短产气杆菌细短杆菌、假单孢杆菌双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌噬菌体青霉菌不同杂菌的种类对发酵的影响

一、染菌隐患的检查显微镜检查法染菌隐患的检查肉汤培养法酚红肉汤培养基染菌隐患的检查平板划线培养或斜面培养检查法以平板划线和肉汤培养结果为主要根据要定期取样，取样时防止外界杂菌混入倒平板空培养待测样品划线培养观察注意事项2、无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。3、无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。

回1、无菌试验时，如果连续3个时间的肉汤发生变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。染菌隐患的检查发酵过程的异常现象观察法溶氧异常排气中的CO2异常变化杂菌是好气性微生物，溶解氧在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量含量增加；噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。

还可以根据其他的一些异常现象，如菌体生长不良、PH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。其它异常现象回染菌率的统计以发酵罐染菌批(次)为基准，染菌罐批(次)应包括染菌重消后的重复染菌批(次)在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。染菌率(％)=发酵(罐)染菌批(次)／总数罐批(次)*100%二、发酵染菌的原因对整个发酵过程的危害极大。严重干扰生产菌的生长繁殖。干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。影响相对较小。不同生产阶段染菌对发酵的影响种子培养期染菌发酵后期染菌发酵前期染菌发酵中期染菌将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。使发酵大面积染菌。一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败。染菌几率较大。不同染菌原因对发酵的影响种子带菌设备渗漏空气带菌培养基或设备灭菌不彻底染菌原因的分析国外一发酵工厂的染菌原因分析染菌原因的分析国内一发酵企业染菌的原因分析a.从染菌的规模来分析染菌原因

大批发酵罐染菌：空气系统部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或消沫剂管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备及管路灭菌死角个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。b.从染菌的时间来分析发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理c.从染菌的类型来分析耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底球菌、酵母：空气净化系统、冷却系统霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格三、杂菌污染后的挽救和处理种子培养期染菌的处理种子罐染菌发酵罐×备用种子有无重新制备种子物料管道供气管道彻底灭菌杂菌污染后的挽救和处理发酵前期染菌的处理培养基中碳、氮含量高终止发酵，重新灭菌再接入种子进行发酵培养基中碳、氮消耗量多放掉部分料液，加入新鲜料液，重新灭菌再接入种子进行发酵杂菌污染后的挽救和处理发酵中后期染菌的处理轻微染菌适当加入杀菌剂或降低温度、控制补料量。代谢产物已达一定水平产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐加热至１２0℃，保持30分钟后排放无提取价值的发酵液杂菌污染后的挽救和处理染菌后对设备的处理加热灭菌至120℃以上、保持30min后才能使用甲醛熏蒸或溶液浸泡12h以上处理四、预防噬菌体的危害利用细菌或放线菌进行的发酵容易感染噬菌体噬菌体直径约0.1微米，可以通过细菌过滤器，所以通用的空气过滤器不易将其除去。引起原因：设备的渗漏空气系统、培养基灭菌不彻底噬菌体的防治措施加入噬菌体抑制剂将培养液重新灭菌再接种（噬菌体不耐热，７０－８０℃经５分钟即可杀死）。补入适量的未感染噬菌体的发酵液或促使菌种生长的生长因子，抑制噬菌体的生长。五、防止染菌的要点（一）强化空气净化过程1．空气净化流程的选择2．过滤介质的选择3．过滤介质的填装4．空气净化系统的管理（二）原料的预处理1．原料除杂：防止机械受磨损2．粉碎：减少固体的团块3．浸泡：使营养物质便于菌体的利用4．糊化、和糖化：大分子物质分解为小分子物质，易于菌体利用饱和蒸汽，严格控制含水量稳定蒸汽压力，保证灭菌质量活蒸汽灭菌（三）对蒸汽的要求定时检查设备的渗漏对设备的死角要进行处理（四）设备的灭菌法兰连接死角发酵工厂的有关管路要保持光滑、畅通、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会渣滓在罐底形成的死角培养基在罐底形成的膜层，有一定的绝热作用，容易形成死角。不锈钢衬里的死角发酵液通过裂缝进入衬里和钢板之间，窝藏在那里形成死角。采用复合钢板制造发酵罐不产生死角接种管路的死角种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。应该在1处焊接上一个排气阀。排气管的死角罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。所以排气管不宜过大或过小。不合理补料管配置造成的死角不合理的补料管也容易造成死角压力表安装不合理造成的死角压力表安装不合理容易造成死角定期检测发酵设备及管道发酵设备的定期检查1.搅拌系统转动有无异常2.机械密封是否严密3.罐内的螺丝是否松动4.罐内的管道有无堵塞5.罐体连接阀门是否严密发酵罐气密性的检查方法是维持温度不变，观察罐压是否恒定管道、阀门的定期检查管道容易因为各种原因发生渗漏导致染菌管道与阀门及主体设备的连接处、变径连接处、与管件的连接处由于热胀冷缩、物料腐蚀等作用容易发生渗漏检查方法：在管路系统中压入碱液，然后在可疑的地方用浸渍酚酞的白布拭擦，如出现红色，则为渗漏点。阀门的渗漏发酵设备中使用最多的附属设备是阀门，其中使用最多的是截止阀。阀心轧坏填料的渗透(五）无菌室接种、移种等无菌操作必须在无菌室内进行要求：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30min，然后倒置