生物饵料培养学课件王珺-海南大学

《生物饵料培育学》试验课件王珺海南高校海洋学院2010年6月YOURSITEHERE试验一单细胞藻浓度的测定【试验目的】1.驾驭用血球计数板计数单细胞藻的方法。2.驾驭运用分光光度计进行单细胞藻类计数的原理、方法。【试验原理】1.制作工作曲线取确定量的单胞藻液，稀释成5个梯度，分别用分光光度计测定其吸光度（O.D.），并用血球计数板测定相应藻液的藻细胞个体浓度，由于藻细胞浓度与吸光值的大小成正比关系，依据各组数据绘出吸光度-藻细胞浓度的相关曲线，即工作曲线。YOURSITEHERE1.1血球计数板计数的原理血球计数板是一块比一般载玻片厚的载玻片特制而成的，板的中部有一“H”形的凹沟，在凹沟包围的上、下两块地方比凹沟外的两条高起的边低0.1mm，在此部的中心划线为一具有精确面积的大小方格，在其中分为九个方格，每一大方格的面积是1mm2，在四角的大格又分为16个中格，在中心的大格分为25个中格，每一中格分为16个小格，共400个小格；另外一种计数板的中心大格分为16个中格，每一中格分为25个小格，总数400个小格，加盖玻片后，每一大格即形成一个体积为0.1mm3的空间。2．测定被测藻液的吸光度。3．依据工作曲线查出藻液相应吸光度的藻细胞浓度。YOURSITEHERE【试验用品】1.试验器材分光光度计、显微镜、电子天平、干燥箱、血球计数板、计数器。2.试剂鲁哥氏液。3.试验材料比色管（每组6支）、吸管、擦镜纸、单胞藻液500ml、待测藻液500ml、10ml移液管（每组6支）、50ml试剂瓶、消毒海水500ml、蒸馏水。YOURSITEHERE【试验步骤】一、分光光度计计数法1.制作工作曲线

取单胞藻液20ml置于比色管中，并稀释成5个浓度梯度（建议第一浓度是其次浓度的2倍，依次类推），以培育液作为参比，用分光光度计分别测定其吸光度（O.D.），并用血球计数板测定相应藻液的藻细胞个体浓度，由于藻细胞浓度与吸光值的大小成正比关系，依据5组数据绘出吸光度-藻细胞浓度的相关曲线，即工作曲线。⑴用培育液作为参比，分别测定相应的5个浓度梯度藻液的吸光度（绿色的藻类一般选择的波长为720-750nm；金藻门藻类、硅藻门藻类一般选择的波长为420nm）。YOURSITEHERE（2）用血球计数板分别计数工作曲线用的藻细胞浓度。

①把血球计数板及盖玻片擦洗清洁、平放在桌上、并盖好盖玻片。②摇匀工作曲线用的藻液，用一支干净的平口微吸管吸取藻液，快速把吸管放在计数板旁的盖玻片边缘处，轻压橡皮头，使藻液流入计数板内（假如样品是有运动实力的种类，则应加入碘液杀死，才能取样计数）。③稍停一分钟后，在低倍镜下（细胞太小需用40×10倍）计数中心大格（400个小格）和东北、西北、西南、东南等4个大格（16个中格），每个样品重复计数两次，然后取其平均值。得：1ml水体的藻类细胞数目=计数平均值×稀释倍数×10000个（简记：万个/ml）YOURSITEHERE2．测定被测藻液的吸光度。3．依据工作曲线求出藻液相应吸光度的藻细胞浓度（或由公式：被测藻液的藻细胞浓度=工作曲线中总的藻细胞浓度/工作曲线中总的吸光度×被测藻液的藻细胞吸光度）。YOURSITEHERE【留意事项】1.血球计数板计数时，藻液不能溢出盖玻片上方，若有溢出，需冲洗干净，重新取样，留意限制藻液流入量，不能过多，也不能过少，应充溢计数板的部分，不能有气泡。2.应留意摇匀后，再取样进行测定或计数。3.假如藻细胞浓度太大，应稀释后才计数，计数结果应乘以稀释倍数。4.运动的藻类，应杀死后才能计数。（建议：稀释液中含有固定液）【作业与思索】1.绘制工作曲线。2.计算出你测定的单细胞藻的细胞密度。3.你是如何削减计数所造成的误差？YOURSITEHEREThankyou!YOURSITEHERE试验二单细胞藻培育的容器、工具与用水的消毒【试验目的】学习并驾驭培育单细胞藻的容器工具及用水的消毒方法，为今后成功培育单细胞藻打基础。【试验原理和基础学问】单细胞藻培育用的工具、容器及水都必需经过严格消毒，尽可能杀死一切生物，以免污染影响藻类生长和繁殖。YOURSITEHERE【试验用品】一、试验器材仪器设备：恒温干燥箱、电炉、电子天平、充气泵。工具容器：250ml三角烧瓶（每人2只）400ml烧杯30只3000ml三角烧瓶10只(6人/组)搅拌棒20根移液管（5或10ml）30支塑料桶4个移液管（1ml）30支乳胶管若干容量瓶（100ml）30只量筒100ml30只二、药品浓硫酸、重铬酸钾、漂白水或次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠。洗液的配制方法：称15g重铬酸钾至干燥的烧杯中，然后加入200ml粗硫酸，搅拌并加热至重铬酸钾溶解，即得洗液，冷却后将上清液倒入试剂瓶中备用。三、试验材料海水200L、淀粉碘化钾试纸2包、充气管、充气石10粒。YOURSITEHERE【试验操作步骤】一、工具、容器消毒方法1．洗液消毒法全部待用三角瓶、烧杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自来水（加去污粉）冲刷干净，然后倒入少许洗液，沿着内壁渐渐转动器皿，使其全部浸泡，放置10min后，将底部洗液回收（以备后用），然后用自来水冲净瓶子，把瓶口朝下晾干。移液管应用洗耳球吸取洗液，使其浸泡内壁，10min后，用自来水冲净内2．烘箱干热消毒法将洗净、凉干的玻璃器皿（移液管、金属工具等应用报纸或牛皮纸包扎好），扎瓶口用的纸，棉塞均放入烘箱。打开通气孔，接通电源，加热，待温度上升至120℃时关闭通气孔（在升温过程中，假如绿灯熄灭，红灯亮，表示箱内停止加热），恒温2h后，断电停止加热，然后待温度自然冷却至60℃以下，才能打开烘箱门取出容器、工具（试验室保种通常并用洗液消毒法和加热消毒法）。3．煮沸消毒小型的容器、工具可放入锅中，加水煮沸消毒15-30min，可杀死细菌的养分体，假如在水中加入2%Na2CO3可促使芽孢死亡。较大的三角烧瓶，可在瓶内加少量淡水，套上纸或放一只一般的玻璃漏斗，煮沸消毒15-30min，可使整个瓶壁消毒。然后倒出淡水，盖上消毒的牛皮纸。、外壁。

YOURSITEHERE二、培育用水的消毒方法1.脱脂棉过滤法取一桶海水置于高处，接好过滤装置、然后限制夹子，渐渐滴水过滤2L。2．加热煮沸消毒法将经脱脂棉过滤的海水，放至电炉烧开，冷却至室温（试验室保种通常并用脱脂棉过滤和加热煮沸法）。3．漂白水消毒法每人取2L过滤海水加入漂白水（含有效氯10﹪）0.5ml，搅拌匀整后盖上以防氯气逸出。静止放置16-24h时消毒后再加入等量硫代硫酸钠中和，充气2h，然后用淀粉碘化钾试纸测试是否有余氯（单胞藻二级培育、三级培育常用）。试纸无变蓝表明无余氯存在，即可运用。YOURSITEHERE【留意事项】1.用加热法消毒培育用水时，三角瓶内的水量不能超过瓶子的2/3，瓶外面不能有水珠，瓶口用纸盖住，不要绑紧。2.洗液在瓶子内转动时，留意瓶口不能对着自己，也不能对着他人。3.干热灭菌过程中，试验者不能离开，严防恒温调整的自动限制失灵而造成平安事故。4.烘箱内的温度需冷却至60℃以下，才能打开烘箱门取出工具、容器。【作业与思索】1.培育单细胞藻的工具、容器的消毒有哪几种方法？2.单细胞藻培育用水的消毒有哪几种方法？3.单细胞藻藻种应如何保藏？YOURSITEHEREThankyou!YOURSITEHERE试验三单细胞藻培育液--母液的配制【试验目的】驾驭培育液配制的原理、一般方法和步骤，为今后成功培育单细胞藻打基础。【试验原理和基础学问】单细胞藻大量生长繁殖，必需从环境中吸取各种养分元素，包括氮、磷、铁和微量元素等单细胞藻在不同配方的培育液中生长效果不同，因此要依据各种单细胞藻的生理需求选择合适的培育液。把养分元素依据培育液配方进行高浓度协作（而且稀释液用蒸馏水或去离子水），一般浓缩1000倍，配成母液。目的是培育便利，母液不能干脆用于培育单细胞藻类，必需稀释后才用。一般每升消毒海水或淡水中加入1ml母液，即为培育液。YOURSITEHERE【试验用品】一、试验器材电子天平、电炉、容量瓶、烧杯、搅拌棒、试剂瓶、100ml量筒、吸管、10ml移液管、耳球、微量注射器。二、药品NaNO3、（NH2）2CO、KH2PO4、FeSO4.7H2O、MnSO4、EDTA-Na2、VB1、VB12、Na2SiO3。三、试验材料蒸馏水【试验操作步骤】1．“宁波高校3号”培育液配方（母液）NaNO3100gFeSO4.7H2O2.5gKH2PO410gMnSO40.25gEDTA-Na220gVB160mgVB1250µg蒸馏水1000ml培育海水绿藻类、金藻类、硅藻类等运用。在培育硅藻时在此基础上加入0.02g/LNa2SiO3，培育螺旋藻时应加2g/L的NaHCO3。YOURSITEHERE2.配制步骤：（1）称量和溶解配制母液100ml。按配方先称取NaNO3放入干净的烧杯中，加入约60ml蒸馏水，搅拌使NaNO3完全溶化。然后再依次称取其他各成分，逐一溶解，最终一起倒入100ml容量瓶，再用蒸馏水冲洗烧杯2-3次，并转移到容量瓶中，最终用蒸馏水加至刻度。（在本配方中FeSO4、MnSO4应与EDTA-Na2一起加热溶解）（2）压紧容量瓶盖，将容量瓶上下颠倒n次，使其混合匀整，倒进经消毒的试剂瓶内，并贴上标签（母液名称、配制人、日期）。（3）配制0.5%Na2SiO3称0.5gNa2SiO3置于干净的烧杯中，加入约60ml蒸馏水，搅拌溶解，倒进100ml容量瓶，用蒸馏水冲洗烧杯2-3次并转移至容量瓶中，定容100ml。上下颠倒容量瓶n次，使其混合匀整，倒进经消毒的试剂瓶内，并贴上标签（贮液名称、浓度、配制人、日期）。YOURSITEHERE【配制母液应留意事项】1.各种养分盐应逐一称量、逐一溶解，倒进容量瓶定容，然后再倒入试剂瓶保存。2.稀释液必需加蒸馏水或去离子水。3.难溶解的物质必需与EDTA-Na2一起络合加热溶解。4.待温度冷却至低于60℃时，才能加入维生素，以免失效。5.留意加入烧杯中溶化养分盐的水量应少于所须要定容的水量。【作业与思索】1．单细胞藻类培育液配制的操作过程中应留意什么问题？2．单细胞藻类的全培育液配方应包含哪些成分?3．试述该配方中的N、P比是多少？YOURSITEHEREThankyou!YOURSITEHERE试验四单细胞藻一级培育【试验目的】驾驭单细胞藻一级培育的基本操作与管理，从而有可能做到有支配地培育足够数量的符合质量的单细胞藻。【试验原理和基础学问】单细胞藻在适宜的生态条件下可以生长繁殖，在不同配方的培育液中生长效果不同，因此要依据各种单细胞藻的生理需求选择合适的生态环境和养分盐进行培育。YOURSITEHERE【试验用品】一、试验器材恒温干燥箱、250ml三角烧瓶、电炉、温度计、盐度计、3000m烧瓶、10m移液管、100ml量筒、扎瓶口的牛皮纸、橡皮圈、长镊子、剪刀、标签纸、（配制培育液用：电子天平、电炉、烧杯、搅拌棒、容量瓶、试剂瓶）。二、试剂固定液、宁波高校3号母液、洗液。三、试验材料小球藻2000ml、扁藻2000ml、等边金藻2000ml、消毒海水。YOURSITEHERE【试验操作步骤】1.培育容器、工具的消毒。各种玻璃器皿先用去污粉刷洗干净，再用洗液消毒、冲洗干净后，晾干，放入烘箱120℃消毒2h，待温度低于60℃后才能打开烘箱门取出器皿（提前消毒）。2.煮沸消毒海水。用脱脂棉过滤海水2000ml于三角烧瓶中，放至电炉烧开，自然冷却到室温（提前准备）。3.用漂白水消毒海水。取海水2000ml于三角瓶中，加入漂白水0.5ml(含有效氯10%)，混均，盖上盖子，避开氯气逸出，消毒时间一般为下午5点至次日上午7点，请勿在上午配制和消毒，因光照会使氯气分解，影响消毒效果。培育液的还原一般接受消毒液量的10%（如含有效氯10%的1L漂白水，可加入100g克硫代硫酸钠还原），将称量好的硫代硫酸钠用开水溶解后倒入消毒海水中，摇摆使之彻底还原，1-2h后用淀粉碘化钾试纸测试是否有余氯，若无余氯即可接种（提前准备）。4.接种前，先洗净手，擦干后用75%的酒精棉球消毒。

YOURSITEHERE【试验操作步骤】5.在消毒海水中加入3号母液2ml，摇摆烧瓶，使养分盐扩散匀整并复原原海水中气体溶解量。6.用量筒分别量取80ml培育液，加入已消毒的三角烧瓶中，再用移液管移取20ml小球藻（或扁藻、金藻）藻种加入三角烧瓶中。（一般先加培育液，后加藻种）7.摇摆三角烧瓶，用消毒移液管取出5ml接种好的藻液，用于测定接种藻细胞浓度N0。8.将培育瓶置于适宜的光照和温度下进行培育管理，每天摇摆2-4次，视察微藻的生长状况并做好记录，一周后，再次测定培育的藻细胞密度。YOURSITEHERE【留意事项】1.用洗液消毒后的瓶子不能再用刷子刷内壁，以免刷子带来污染物。2.留意全部接触藻液的工具、容器都必需经过严格消毒。【作业与思索】1.培育结束后提交培育报告，描述单细胞藻的生长状况。2.在连续晴天条件下，单细胞藻在下午或次日早上突然下沉，请你说明缘由并说明应实行的措施。3.比较煮沸消毒法与漂白水消毒法的培育效果。YOURSITEHEREThankyou!YOURSITEHERE试验五轮虫的分别与培育【试验目的】驾驭轮虫的分别、驯化及培育管理技术，为今后成功培育轮虫打基础。【试验原理和基础学问】用小口吸管取轮虫水样滴在干净的载玻片上，排成一排4-6滴，置于解剖镜或显微镜下（4倍或10倍物镜）视察，若发觉轮虫就用小口吸管吸出，放在另一滴过滤海水中清洗并显微视察，若发觉有轮虫而没有其他浮游动物，用小口吸管吸出进行培育或用冲水法将轮虫冲至盛有过滤水样的培育瓶中进行培育。YOURSITEHERE【试验用品】一、试验器材显微镜、pH计、盐度计、浮游生物网、500ml烧杯或玻璃缸、加热棒、吸管、载玻片、充气泵、气石。二、试剂鲁哥氏液。三、试验材料轮虫水样、扁藻、等边金藻、小球藻、角毛藻。YOURSITEHERE【试验操作步骤】一、分别培育1.捞取轮虫每小组成员用浮游生物网在小虾（鱼）塘中拖网，捞取轮虫，最好是在早晨，轮虫向水表层游动时捕捞，效果更好（提前准备）。2.准备培育液测定轮虫原生活环境的盐度、pH值等，用脱脂棉过滤海水1000ml，并调整培育轮虫用水的盐度和pH值，使其与原生活环境的条件相近。将海水分装在烧杯中，每瓶装150ml水量。3.分别用小口吸管取轮虫水样滴在干净的载玻片上，排成一排4-6滴，置于解剖镜或显微镜（10倍或4倍物镜）下视察，若发觉轮虫就用微吸管吸出，放在另一滴过滤海水中清洗并显微视察，若发觉有轮虫而没有其他浮游动物，再次用小口吸管吸出进行培育或冲水法（仅含有轮虫，而没有其他浮游动物）将轮虫冲至盛有过滤水样的培育瓶中进行培育，投喂小球藻或扁藻，