(3.5.3)-稀释法药敏试验

微生物检验微量液体稀释法药敏试验

(microdilutiontest)【知识目标】

熟悉微量稀释法药敏试验原理方法。

【能力目标】

会采用微量稀释法药敏试验选择评价抗菌药物抗菌效果。

任务目标聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入100μl浓度为105CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃16～20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代培养，经35℃过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.9％原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。试验原理：稀释法：抗菌药物母液配制稀释法抗菌药物母液的稀释在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。稀释法加液稀释法增菌

挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终浓度105CFU/ml。稀释法：制备菌悬液

用微量加样器接种100μl到96孔中，盖上盖板。同时作阳性、阴性对照。稀释法接种手工看浊度或仪器自动判读。按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物为敏感、耐药和中介。稀释法：结果判读稀释法是作()测定，K-B法是作()测定。作答主观题正常使用主观题需2.0以上版本雨课堂稀释法中稀释的是(),测定的是()。作答主观题正常使用主观题需2.0以上版本雨课堂结果判别是以()的药物最低浓度即为该待测菌的()。再以0.01ml容量接种环从肉眼无菌生长的试管中移一环于血琼脂平板作次代接种培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9%的原始种入的细菌即为该菌的()。作答主观题正常使用主观题需2.0以上版本雨课堂原理：

E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。三、E-TEST1.挑取16～20h的菌落2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。操作方法：3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，90mm平板只能放置1～2试条。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。(1）联合药敏试验的方法

联合药敏试验的方法很多，其中纸片法最为常用。下面就介绍纸片法的试验方法。与纸片扩散法类似。先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃孵育过夜，取出观察结果。四、联合药物敏感试验联合药物敏感试验可出现四种结果：A.无关作用：甲+乙=甲单或乙单B.拮抗作用：甲+乙＜甲单或乙单C.相加作用：甲+乙=甲单+乙单D.协同作用：甲+乙＞甲单+乙单（2）结果判断A.无关作用：甲+乙=甲单或乙单细菌对两药均耐药细菌对甲耐药对乙敏感细菌对两药均敏感，抑菌环交界角尖锐。B.拮抗作用：甲+乙＜甲单或乙单细菌对甲药耐药，对乙药敏感，甲药对乙药发生切割状拮抗现象。细菌对甲乙两药均敏感，乙药对甲药发生扇圆形拮抗现象。细菌对甲乙两药均敏感，甲乙两药发生相互切割状拮抗现象。C.相加作用：甲+乙=甲单+乙单甲乙两药抑菌环交界角钝圆。D.协同作用：甲+乙＞甲单+乙单甲乙两药抑菌环交界角平直细菌对甲药不敏感，乙药抑菌环向甲药扩