酒精发酵实验

酒精发酵实验方案一、实验目的掌握酵母菌的筛选方法复习用显微镜观察菌形态的操作步骤掌握酵母生产性能的测定：酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、掌握用DNS法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力学习酒精出酒率的计算二、实验器材实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电磁炉，水浴锅，微波炉，移液枪，枪头，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，连通器，天平，酒精计，超净工作台，摇床，试管，紫外分光光度仪，培养皿，玻璃棒，涂布棒，离心管，离心机，漏斗，滤纸，玻璃珠，pH试纸2.试剂及药品碘液，20%盐酸溶液，20%氢氧化钠溶液，500?g/ml标准葡萄糖溶液，玉米粉，糖化酶，马铃薯，酒糟，无水乙醇，蒸馏水，DNS试剂，可溶性淀粉，葡萄糖3.实验材料番茄4.实验培养基PDA马铃薯蔗糖（或葡糖糖）琼脂水PH200g20g15-20g1000ml自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，在加糖和琼脂，定容至1000ml。121°C灭菌30min。DNS试剂酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3,5二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml发酵工艺（技术路线）三、实验步骤（一）酵母菌种的驯化筛选1.酵母菌种的筛选分离筛选采用平板涂布法和划线法。将榨取的番茄汁稀释到10-3、10-4、10-5后在PDA培养基平板上涂布，后置于28C隔水式恒温培养箱中静止培养3d；从分离得到的酵母菌落中挑取一环酵母菌在PDA平板上划线，后置于28C隔水式恒温培养箱中静止培养2d。酒精发酵液的微生物检查1）酵母形态的观察用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。（二）测定指标及其方法1.酵母生产性能鉴定（1）酵母菌产酒精能力（发酵力）的测定本实验主要采取称重法与测放出的CO2量等测定酵母的发酵力。称重法：我们将不同酵母菌产酒精能力的测定和酒精发酵合在一起。2.操作：①糊化：将625mL水加到糖化锅中，按照料水比1：5称取玉米粉125g，在电炉上加热并搅拌，调节pH5.5〜6.0，观察现象，记录下黏度迅速增加时的温度。②糖化：待醪液冷却到60°C，调节pH值至4.0—4.5，用移液枪（按0.6〜0.8%/g淀粉）量取糖化酶加入糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅中，保持温度为60C，维持约10h，用碘液测定糖化液是否含还有淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面降低。③糖化结束后将糖液pH值调至5.0左右。④取一些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量（用DNS法测定）。⑤将糖化好的糖化液分装5个250毫升的三角瓶（每个约150毫升），接种培养24小时的酵母菌，接种量为发酵液的10%（约15毫升）。⑥用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将发酵液放于28-30C的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。（2）酵母菌耐酒精能力的测定：将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤2次，后于30C和不同的酒精浓度（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%）条件下进行试验，定期取样检测活细胞目：菌体的耐酒精能力以酵母细胞增长数表示，酵母细胞增长数（%）=（C1-C0/t）X100%，1和C0分别表示发酵时间为t小时的细胞数和刚开始C时的细胞数，以表示酵母菌在不同的酒精浓度下的耐酒精能力，连续观察5天。（3）酵母凝聚性的测定本实验采用本斯值法。将酵母茵在30C度摇床中摇瓶培养36^离心弃上清液，经无菌水洗涤3次后，称重1g酵母菌泥于刻度15mL的离心管中，注入10mLpH值为4.5的醋酸盐缓冲液，20C水浴中放置20min后，摇动离心管5min使酵母细胞重新均匀悬浮，静置，记录i0min时酵母细胞沉淀的毫升数，即为本斯值。根据本斯值判断酵母菌株的凝聚性强弱。（三）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定（DNS法）发酵前后发酵液中还原糖含量的测定（酵液中还原糖含量的测定本实验采用DNS法，利用可见光分光光度计，在540nm波长下进行比色测定，测定酒样的光密度值，确定番茄酒中总糖含量，操作简捷，杂质干扰少。酶活的定义：1mL酶液于上述条件下，1min内产生1?mol葡萄糖量的酶量定义为1个酶活力单位“IU”。1）标准曲线的绘制本实验采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS）。测定酶解液中还原糖含量，按表1进行葡萄糖标准曲线溶液配置，用分光光度计540nm下进行比色测定，用空白管溶液调零后，测定各管光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。表1葡萄糖标准曲线溶液配置表TablelPreparationofsolutionforglucosestandardcurve项目空白002.01.510.20.21.81.520.40.41.61.530.60.61.41.540.80.81.21.551.01.01.01.561.21.20.81.571.41.40.61.581.61.60.41.5含糖总量(mg)葡萄糖液(mL)蒸馏水(mL)DNS试剂(mL)加热冷却蒸馏水定容沸水浴加热10min立即用流水冷却定容至25mL2)发酵前后发酵液中还原糖含量的测定取5ml糖化液进行过滤，滤液用pH4.6的醋酸盐缓冲液进行稀释，大约稀释10倍。取甲、乙两支试管，甲试管加入1ml稀释的糖化液，乙管加入1mlpH4.6的缓冲液，分别加入2mlpH4.6的醋酸盐缓冲液和2mlDNS试剂。混匀后沸水浴加热5min，立即冷却定容到5ml。混匀分别于540nm处比色，用乙管调零，测3次，记录光密度值。然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量Gmg。再由下式计算样品中还原糖的含量：还原糖含量(mg/mL)=Ga式中：a一稀释倍数G一还原糖量(mg)酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定原理：原理：糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉-1，4-麦芽糖苷酶(p-淀粉酶)、淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶(糖化酶)和淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)本实验的研究对象是淀粉a-1，。4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。碘量法原理：碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。I2+2NaOH-NaIO+NaI+H2ONaIO+CH2OH(CHOH)4CHO—CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。I2+2Na2S2O3-Na2S4O6+2NaI仪器：仪器：吸管(25ml、10ml、5ml、2ml)定碘瓶；碱式滴定管；恒温水浴锅；分析天平。试剂：试剂：(1)2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉2g(预先100°C烘干约2h至恒重)，用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。(2)0.2mol/LpH4.6醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa・3H2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 (3)20%氢氧化钠溶液(4)0.1mol/L碘液称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。（5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （6）1mol/L硫酸溶液量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80ml蒸馏水中，冷却后定容至100ml，摇匀。（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液配制：称取结晶硫代硫酸钠（Na2S2O3・5H2O）24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。实验步骤：1.待测酶液的制备.取发酵液的滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。2.酶活力的测定.于甲、乙两支管中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/LpH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40°C的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中加入待测酶液2ml（酶活总量约100-170单位），乙管中加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h后，取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。计算：计算：糖化酶活力单位的定义：在40C、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。酶活力单位=（A-B）NX90.05X（1/2）X（32.2/5）Xn式中：A——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml）；B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）；N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；90.051mllmol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质（mg）；1/2折算成1m1酶液的量32.2——反应液总体积（ml）5——吸取反应液样品的体积（ml）；n——酶液稀释倍数。注意事项：注意事项：1）酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸钠（空白和样品）的差数为3〜6ml左右（以每毫升约50~90单位为宜）。2）配制碘液时碘先和碘化钾溶解，溶解完全后再稀释。（五）酒精蒸馏与含量的测定：酒精蒸馏与含量的测定比重计测定法：1.材料：①酒精比重计。②100ml量筒。③温度计。2.操作:①蒸馏:装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取100ml发酵液，放入500ml的蒸馏瓶中，加100ml水。迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容量瓶用水洗净后，置冷凝管下端收集馏出液100ml，停止蒸馏，摇匀备用。②测定：将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平。③校正：根据所量的酒精度和温度、查表校正为20°C时酒精度。实际发酵产无水酒精发酵率（%）=理论发酵产无水酒精X100成熟发酵醪中含酒精=发酵液中糖份％X0.6479X1000.6479一发酵糖转化为酒精的转化系数（六）计算酒精出酒率葡萄糖发酵生成乙醇的反应式为：C6H12O6-2C2H5OH+2CO2由于淀粉糖化液中几乎都是可发酵性糖，可按照上式算出糖醇转化的理论值。糖利用率=（实际所得酒精量/理论上所得酒精量）X100%酒精对糖或对淀粉的转化率是衡量酒精生产水平的一项重要指标，直接影响生产成本。它与酵母的活性及用量、发酵时间、温度、pH值及是否污染上杂菌等许多因素都有关，由于本实验没有最终获得酒精产品，所以，仅根据发酵醪体积和酒精含量估算转化率，也可利用CO2的产生量计算酒精产量并对结果应进行讨论。实际发酵产无水酒精发酵率（%）