核酸分子杂交与应用描述

核酸分子杂交技术与应用2/24/20231核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecularhybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学探讨中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。2/24/202322/24/20233核酸分子杂交的基本原理与分类核酸分子杂交的基本原理：DNA分子由两条互补的单链形成的双螺旋结构。维持结构稳定的力有三：1、两条链间互补碱基的氢键；2、碱基间的积累力(范德华力)；3、中和链内的负电荷。变性：在理化因素作用下，双螺旋结构间的氢键断裂，两条链解开形成单链的过程。2/24/202342/24/20235变性温度(Tm)：核酸分子热变性时，从起先变性到变性结束，是在一个很窄的温度范围内进行的，当变性进行到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。2/24/202362/24/20237影响变性的因素：1、碱基组成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，两者之间的关系可以用阅历公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3为无G＋C存在时的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm约上升0.41oC。2/24/20238影响变性的因素：2、溶液的离子强度DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性增加，Tm值上升。2/24/20239影响变性的因素：3、pH值pH值在5～9范围内，Tm值变更不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的实力。当pH大于11.3时全部氢键均被破坏，DNA完全变性。4、变性剂可以干扰碱基积累力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC。2/24/202310复性：变性核酸分子在合适的条件下重新形成双螺旋结构的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25oC的温度下维持相当长的一段时间，则可使之复原到自然的双链结构状态。复性的速度受以下因素影响：1、DNA浓度DNA浓度越大复性速度越快；2、DNA的分子质量大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢；2/24/2023113、温度温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；4、离子强度5、DNA分子的困难性DNA总量确定时，基因组越困难，其中特定依次的拷贝数越少，互补依次的浓度越低，复性反应速度越慢。2/24/202312分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。探针(probe)：在核酸变性试验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所运用的带有标记的单链核酸分子。2/24/202313核酸分子杂交分类：以杂交分子分类：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。以探针标记分类：以杂交介质分类：液相杂交与固相杂交。液相杂交：菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及基因芯片等技术。2/24/202314液相杂交(solutionhybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反应，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸取特性变更分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶疼惜分析法、核酸酶S1疼惜分析法。2/24/202315RNA酶疼惜分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到疼惜的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体，用RNase降解非杂交部分RNA后分析杂交结果。2/24/202316RNA酶疼惜分析法的应用：mRNA定量mRNA未端定位内含子在相应基因中的位置2/24/202317RNA酶疼惜分析法的主要步骤：1、制备待测RNA从细胞或组织中提取总RNA或mRNA；2、RNA探针标记接受体外转录的方法制备和标记探针；3、分子杂交：将待测样品RNA和RNA探针在液相中杂交，杂交前将样品和探针变性，破坏二级结构；4、RNA酶消化单链RNA；5、电泳分析杂交分子。2/24/202318核酸酶S1疼惜分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理与RNA酶疼惜分析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地降解单链DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。接受M13体系克隆和扩增特定基因的单链DNA片段，在合成过程中加入核素标记物，即可合成出高放射性的单链DNA探针。将探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA杂交双链。酶解后进行分析。2/24/202319核酸酶S1疼惜分析法可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。液相杂交的优点：设备简洁、操作便利。液相杂交的缺点：过量未杂交探针难以除去，产生高背景；同源与异源核酸均可形成双螺旋结构使得杂交结果难以分析。2/24/202320固相杂交：将欲分析的样品先结合在固相支持物上，再与探针进行杂交反应。杂交结果可用仪器或放射自显影技术分析杂交结果。固相支持物的选择：可用于固相支持物的种类很多。一种良好的固相支持物应具备以下几个特性：1、具有较强的结合核酸分子的实力；2、与核酸分子结合后不影响与探针的结合；3、与核酸分子的结合稳定坚实；4、非特异性吸附少；5、具有良好的机械性能便于操作。2/24/202321硝酸纤维素滤膜优点：具有较强的吸附单链DNA或RNA的实力，特殊是在高盐浓度下，其结合实力可达80～100μg/cm2。吸附的单链核经真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而结合在硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜具有杂交信号本底低的特点广泛用于各种杂交试验。缺点：与单链核酸的结合实力不特殊坚实，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜时(特殊是在高温下)DNA会出现脱膜现象，硝酸纤维素膜质地较脆使操作不便。2/24/202322尼龙膜：是目前较志向的一种核酸固相支持物，它有多种类型，不同类型的膜上网孔大小不同。经正电荷基团修饰后与核酸的结合力更强。尼龙膜与核酸的结合实力为350～500μg/cm2。经烘烤或紫外线照射后，特殊是紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上带正电荷的基团相互交联，使结合更加坚实。2/24/202323菌落杂交：主要用于克隆筛选的固相杂交。2/24/202324Southern印迹杂交：Northern印迹杂交：基本原理与Southern相同，但目的被分析样品为RNA。选择的变性剂为甲醛。斑点杂交及狭缝杂交：原位杂交(insituhybridization)：基因芯片技术：2/24/202325杂交过程预杂交：为了削减非特异性杂交反应，在杂交前应进行预杂交，将非特异性DNA位点封闭。常用的封闭物有两类：其一是变性的非特异性DNA，大多接受鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封闭DNA上的非特异位点；封闭膜上与非特异性DNA结合位点。2/24/202326预杂交液的配制6×SSC（1×SSC为0.15mol/LNaCl和o.o15mol/L柠檬酸）5×Denhardt’s溶液0.5％SDS100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA50％甲酰胺(可不用)50×Denhardt：聚蔗糖(Ficoll400)5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(组分V)5g加水至500ml，分装后保存于－20oC2/24/20232710mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器通过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置－20oC保存，运用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。甲酰胺：运用前用DowexXG8混合床阴阳离子交换树脂处理1小时，小量分装后置－70oC保存。2/24/202328膜的处理：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6×SSC溶液中2分钟，使其充分潮湿。预杂交：将潮湿的滤膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入预杂交液，尽量解除其中的气泡后用封口机封口。2/24/202329温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；加入50％甲酰胺时，恒温42oC)，温育1～2小时，也可延长至12～16小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜表面的气泡，否则这些气泡将阻碍杂交液与滤膜的接触。(假如将预杂交液加热到适当温度后再加入塑料袋内，可以削减气泡产生)。2/24/202330杂交：杂交反应是单链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在确定的温度下杂交复性的过程。杂交包括以下过程：1、杂交液配制：同预杂交液2、探针变性：放射性标记的探针为双链时，于100oC加热5分钟变性并快速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性2/24/2023313、打开预杂交袋弃去预杂交液，加入杂交液及变性的探针。解除气泡后重新封好口4、在与预杂交相同温度下，保温8～16小时2/24/202332洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在确定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体则保留在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。2/24/202333洗膜的操作如下：1、杂交完毕，取出杂交袋，剪去一角，弃去全部的杂交液，取出膜并快速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS溶液中，室温下不断振荡。留意不要使滤膜干燥。2、5分钟后，将滤膜转移至一盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温振荡15分钟。2/24/2023343、将滤膜转移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，37oC振荡漂洗30分钟至1小时。4、将滤膜转移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，65oC振荡漂洗30分钟至1小时。直到用盖革计数器在无DNA区域检测不出放射信号为止。5、室温下，滤膜用0.1×SSC稍稍漂洗。然后置滤纸上吸去溶液，置－70oC放射自显影。2/24/202335非放射性标记探针杂交非放射性标记探针的缺点是杂交后本底信号较强，因此杂交条件与放射性标记探针稍有差别以削减本底。主要变更为用甘氨酸代替杂交液中的牛血清白蛋白，并削减硫酸葡聚糖用量，此法也适用于放射性探针杂交。2/24/202336杂交液组成：50％甲酰胺5xSSC1xFPG25mmol/L磷酸缓冲液25μg/ml变性鲑鱼精DNA5％硫酸葡聚糖0.2％SDS50xFPG1％聚蔗糖4001％聚乙烯吡咯烷酮1％甘氨酸过滤后分装，于－20oC存放。2/24/202337杂交反应的影响因素长探针杂交影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素1、核酸分子浓度与杂交速率：在探针和固定的核酸浓度都很低的状况下，杂交初始速度由探针和核酸浓度确定。当探针是单链而不存在自身互补的区域，杂交的速率随探针浓度的上升而上升。在杂交中可通过提高探针的扩散速率而提高杂交速率，如使小片段探针、减小反应体积提高反应温度和不断振摇等措施。2/24/2023382、高浓度双链探针的杂交：限制性内切酶标记的探针，在杂交过程中可能发生两种反应：1、与固定在膜上的靶序列杂交；2、双链探针的自身退火。双链探针的自身退火可使探针有20％～30％探针不能与靶序列发生杂交，因此尽量运用单链探针。3、碱基组成：G＋C的含量越高，杂交的速率越高，但对速率的影响不明显，可忽视不计。但G＋C含量越高杂交核酸的稳定性越高。2/24/2023394、盐溶液的浓度：对杂交速率的影响：对杂交稳定性的影响：5、温度6、甲醛7、错配的核酸序列：2/24/202340酶联探针属于非放射性探针，探针与生物素或地高辛结合后与氢过氧化酶或碱性磷酸酶连接。杂交反应体积杂交时间2/24/202341探针的种类DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为：基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。2/24/202342探针的种类DNA探针优点：1、多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖；2、DNA探针不易降解3、DNA的标记方法比较成熟。2/24/202343探针的种类RNA探针：可以是标记分别的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是：RNA探针为单链，困难性低，与靶序列杂交反应效率极高因不存在重复序列，因此特异性高本底低缺点：2/24/202344探针的种类寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。优点：可依据须要人工合成相应的序列；因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变更，特殊适用于点突变的检测杂交速度快特异性强缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定2/24/202345探针的标记标记物：标记探针的标记物有两大类1、放射性标记2、非放射性标记非放射性标记又分为：(1)半抗原：如生物素和地高辛，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测(2)配体：如生物素还是一种抗生物素蛋白和链霉素类抗生物素蛋白配体，可以利用亲和法进行检测(3)荧光素：可以被紫外线激发出荧光进行视察，主要用于原位杂交。2/24/202346探针的标记切口平移法标记原理：是目前试验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。2/24/202347DNaseIDNAPolI,α-32P-dNTP2/24/2023482/24/2023492/24/202350标记步骤1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀10x切口平移缓冲液0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mol/LMgSO41mmol/L二硫苏糖醇(DTT)500μg/ml牛血清白蛋白2/24/202351标记步骤3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。以下操作要在同位素工作室中有防护措施的状况下进行操作4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，运用前在室温下放置15～30分钟溶化。要尽量削减冻融次数。2/24/202352标记步骤5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀6、加入0.5μl稀释的DNaseI溶液，混匀7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀注：以上操作均在冰浴中进行8、置14～16oC水浴中保温1～2小时9、加入2μl0.5mol/LEDTA终止反应10、纯化标记的DNA探针2/24/202353探针的标记随机引物法标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。2/24/2023542/24/2023552/24/202356标记步骤1、冰浴中，在一微量离心管内依次加入下列溶液，并混匀20mmol/LDTT1μl5mmol/LdATP、dGTP、dTTP1μl10x随机引物缓冲液1μl标记dCTP3μl水1μl2/24/202357标记步骤2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并快速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上2/24/202358标记步骤4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用终止缓冲液50mmol/LTris.Cl(pH7.5)50mmol/LNaCl5mmol/LEDTA0.5%SDS2/24/2023592/24/202360随机引物标记法特点1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必需接受反转录酶。2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上3、操作便利2/24/2023613’末端标记末端标记属于部分标记。特点是可得到全长DNA片段，但标记活性不高。3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3’标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法T4DNA聚合酶标记法2/24/202362大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法：标记反应步骤：(1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀DNA1μg10xKlenow片段缓冲液2μl2mmol/L3种dNTP(无dATP)1μl[α-32P]dATP30μCi加水至25μl10xKlenow片段缓冲液2μl0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mmol/LMgSO4

1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)500μg牛血清白蛋白2/24/202363(2)加入1单位Klenow聚合酶片段，室温反应30min。(3)加入12μl0.5mol/LEDTA以终止反应。酚/氯仿抽提1次。(4)SephadexG－50柱层析或乙醇沉淀法分别标记的DNA片段。大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法：2/24/202364留意事项：(1)要依据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的标记核苷酸。(2)选择适当的限制酶及α-32P-dNTP,利用DNA聚合酶IKlenow片段的末端填充活性，可以选择性地将DNA双链之中一条链特异地标记。(3)此方法不能干脆用于3’凸出末端DNA的标记。2/24/202365CCTAGGAATTCAATTCCCTAGGEcoRIBamHI加入DNA聚合酶，dNTP(其中一种为标记核苷酸)AATTCCCTAGG2/24/202366T4DNA聚合酶标记法T4DNA聚合酶具有两种功能，5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性。当反应体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶主要表现为外切酶活性。利用这一特性可产生5’凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一为标记核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出标记探针。2/24/202367T4DNA聚合酶，无dNTP加入dNTP,其中一种为标记核苷酸2/24/202368标记反应步骤：(1)在反应管中加入下列试剂并混匀DNA0.2~0.5μg1xT4DNA聚合酶缓冲液2μl加水至20μl(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育(3)加入适量T4DNA聚合酶。(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。(5)SephadexG－50柱层析或乙醇沉淀法分别标记的DNA片段。2/24/2023695’末端标记标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP分子上的γ磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’－OH基团上。因此接受γ-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5’端标记。但核酸样品5’端必需是去磷酸的。2/24/202370PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP2/24/202371标记反应步骤：(1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一个月以上。(2)将DNA样品溶解于少量10mmol/Ltris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：2/24/20237210xCIP缓冲液5μlCIP缓冲液适量加水至48μl置37oC30分钟。加入其次份CIP，接着保温30分钟，即可脱去5’端磷酸基团。0.01U的CIP，可脱去1pmol5’磷酸基团(1.6μg4kb线性DNA的5’端数相当于1pmol)。10xCIP缓冲液Tris.Cl(pH9.0)10mmol/LMgCl21mmol/L