微生物常规实验操作与菌种保藏

微生物常规实验操作与菌种保藏第一页，共三十八页，2022年，8月28日1、实验器皿的准备试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿的准备新的玻璃器皿，一般先用浓度为5%~6%的盐酸浸泡6hs以上，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3遍。旧的玻璃器皿，只需洗干净，同样用蒸馏水冲洗2~3遍即可。洗干净的玻璃器皿倒置晾干或烘干后备用。包装、灭菌。第二页，共三十八页，2022年，8月28日第三页，共三十八页，2022年，8月28日第四页，共三十八页，2022年，8月28日第五页，共三十八页，2022年，8月28日干热灭菌原理：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度（160-170℃）一般165℃，时间2小时。注：干热灭菌温度不能超过180℃，否则包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）一般培养基用121℃，灭菌30min。灭菌结束后先断电源，等压力降为零后再开盖。一般在压力降为零，温度降至约60℃时开盖。灭菌：干热灭菌、湿热灭菌第六页，共三十八页，2022年，8月28日第七页，共三十八页，2022年，8月28日第八页，共三十八页，2022年，8月28日2、培养基的制备制备过程：称量，配制，调pH，分装，灭菌。建议所有药品分别用水溶解后再混合，若药品种类较多则建议前一种药品充分溶解后再加另一种药品，且要边加边用玻璃棒搅匀，待药品完全溶解后，补充水分至所需体积。如果配制固体培养基，需等药品充分溶解好以后，再加入琼脂，并充分搅拌，防止糊底，最后补足所需水分。如果配方中含有淀粉，需先将淀粉用少量冷水调成糊状，然后再在火上加热搅拌并补充水分，待完全溶解后使用。第九页，共三十八页，2022年，8月28日调节pH：培养基溶解均匀后，冷却至室温时用pH试纸测定pH值，然后根据要求加酸或碱（一般用1mol的HCl或NaOH）,要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调pH。培养基的分装：将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热分装。分装时要避免培养基沾染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为以下几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4~1/5。（2）液体、半固体培养基装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积的1/2。第十页，共三十八页，2022年，8月28日第十一页，共三十八页，2022年，8月28日3、斜面摆放斜面摆放时，斜面不超过试管长度的1/2。培养基充满试管底部约1cm，然后再形成斜面。第十二页，共三十八页，2022年，8月28日4、平板的制备一般每皿需培养基约15~20mL。手持培养皿在酒精灯火焰附近打开皿盖，倒入培养基，当培养基覆盖培养皿2/3面积时停止倾倒培养基，盖上皿盖，平放在桌面上。第十三页，共三十八页，2022年，8月28日第十四页，共三十八页，2022年，8月28日5、接种与培养接种方式：斜面接种、液体接种、平板接种。

1、斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，并用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入试管内、冷却、挑菌，立即转入斜面底部，沿斜面划线。第十五页，共三十八页，2022年，8月28日第十六页，共三十八页，2022年，8月28日第十七页，共三十八页，2022年，8月28日2、液体接种由斜面菌种接种到液体培养基中的方法。操作与固体接种方法基本固体接种相似，只是在将接种环送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，轻轻摇匀，即可培养。或者先在长好菌种的斜面试管中加入无菌水，然后用接种环将菌体轻轻洗下，混合均匀后直接倒入液体培养基中。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。第十八页，共三十八页，2022年，8月28日第十九页，共三十八页，2022年，8月28日3、平板接种将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：划线法：见平板划线操作。点种法：一般用于观察丝状真菌，点接于平板表面即可。第二十页，共三十八页，2022年，8月28日第二十一页，共三十八页，2022年，8月28日6、微生物菌种保藏斜面保藏液体石蜡保藏甘油保藏冷冻干燥保藏液氮保藏第二十二页，共三十八页，2022年，8月28日斜面保藏

此方法的优点时简便、可行，使用方便，缺点是保藏时间不长，每隔一段时间需重新移植培养。传代多了，菌种易变异。液体石蜡保藏

液体石蜡需间隙灭菌2~3次，最后于105℃烘干水分。保藏时，液体石蜡液面高出斜面最顶端1cm以上。第二十三页，共三十八页，2022年，8月28日第二十四页，共三十八页，2022年，8月28日甘油保藏，一般甘油的最终浓度为40%，置于-20℃保存。冷冻干燥保藏，先使微生物在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。一般用脱脂牛奶作为保护剂，浓度为10%~12%，8磅（112℃，不超过113℃）灭菌20分钟。液氮保藏，一般用10%的甘油或二甲基亚砜作为保护剂。此外，程序降温过程与步骤十分重要。第二十五页，共三十八页，2022年，8月28日第二十六页，共三十八页，2022年，8月28日第二十七页，共三十八页，2022年，8月28日第二十八页，共三十八页，2022年，8月28日第二十九页，共三十八页，2022年，8月28日第三十页，共三十八页，2022年，8月28日7、微生物的分离、纯化第三十一页，共三十八页，2022年，8月28日涂布操作时，用力要均匀，以防划破培养基。要涂布到菌（土壤）悬液全部渗入培养基方能结束。第三十二页，共三十八页，2022年，8月28日厌氧微生物的分离和培养

Hungate滚管法：Hungate和Bryant等人在分离家畜瘤胃中微生物和沼气微生物时均采用此法。第三十三页，共三十八页，2022年，8月28日8、注意事项酒精灯的使用酒精灯添加酒精时，必须先将火焰熄灭。酒精装量不超过总容积的2/3。实验过程中切勿使酒精等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，在用湿布掩盖灭火，必要时用灭火器。微生物实验操作,首要的是要保证安全，包括实验室安全、人身安全等。第三十四页，共三十八页，2022年，8月28日化培养基时，不要从上面握三角瓶的瓶口，要从侧面捏住三角瓶的瓶口，并且不要从上方观察培养基融化情况，以防培养基喷出伤人。每种培养基不是可以培养所有的微生物的，每种菌种都有适宜的培养基。当我们拿到一个菌种后，一定要将其接种到最适培养基上进行活化。活化好后，用其中的1~2支进行扩繁，再进行下一步试验操作。其它活化好的菌种一定要妥善保藏。第三十五页，共三十八页，2022年，8月28日无菌操作环境的控制微生物无菌操作对环境要求严格，最好设有专门的实验室或无菌操作室。要求环境清洁，人员流动少。超净工作台的使用：细菌、酵母菌与小型丝状真菌要分开在不同的超净台上操作，建议每类菌固定在某个超净台上操作。使用前后开紫外灭菌30分钟左右，并且用之前后都要用75%的酒精擦拭一遍。实验操作后要及时将培养物移出无菌操作台，不要将无菌操作台作为临时培养箱。同时无菌操作垃圾要及时清除，千万不