用离子交换层技术纯化目的蛋白

试验六用离子交换层技术纯化目的蛋白【试验目的】【试验原理】PHPI时，被分别物质带负电荷，可被统的离子强度和PH值以及承受梯度洗脱方法可以使离子交换层析的区分力更高。的种类、交联度、蛋白质溶液和离子交换层析柱平衡液的pH值及离子强度等。通而，此种环境条件对大多数蛋白质来说是不易找到的。通常遇到的状况是，在特的。性〔阳〕离子交换剂对H+Na+的小；强碱性〔阴〕离子交换剂对反离子进展电荷平衡是打算吸附容量的重要因素。pH〔PI〕时，pH环境中，PI>pH，其值相差愈远，蛋白质的碱性愈强带正电荷愈多，愈易被阳离子交换剂吸附。蛋白质是大分子物质，其溶液呈胶体状，因此用离子交换层析技术提纯蛋白孔隙大，以利于蛋白质分之渗透入交换剂的网孔中进展离子交换吸附。蛋白质在离子交换剂上的吸附和解吸附〔洗脱〕受环境中的pH值和离子强择另外一种环境条件〔pH或转变离子强度，使蛋白质从离子交换剂上质的离子交换层析条件〔包括吸附和洗脱两种过程。因此，每一种蛋白质的离进展的而不是承受小型层析柱。通过转变离子浓度和pH值筛选最正确吸附和洗脱条件。依据离子交换介质所带的反离子完全离子化的pH值范围，将其分类为强阳强反离子的结合强度无关。PI来打算。由于在争论工作开头时，人们尚不知道目的蛋白质的PI，所以一般先在生理pH值下对阴、阳两种离子交换剂都做小样试验。由于弱酸、弱碱性离子交换剂在生理pH值下的交换容量也作。PharmaciaSPQ型离子交换介质的pHDEAECMpH范围更宽，更易保持高交换样品性质和纯化目标来选择适宜的离子交换介质。如下表所示：产品纯化 样品性质产品纯化 样品性质/纯化目标 应选择的离子交换阶段 及工作原则 介质〔推举〕捕获及产品粗去除细胞碎片快速浓缩处理量越大越好，Sepharose大颗〔200µM〕分别 最短时间内捕获产品避开产品被降解减交换剂可在短时间里处理UV检测的影大量样品，阳离子交换剂响。介质须耐受高粘度、流速快，对区分率和亲和介质可在捕获产品的要求不高 的同时，去除核酸。中度纯化中度纯化以高选择性离子交换介质去除主要杂蛋白，SepharoseFF〔90µM〕适宜须留意介质载量和区分率之间的平衡介质用于早期纯化，流速不是重要的选择指标 SephanroseHP〔34µM〕可供给更高的区分率精细纯化重要SourcetmSephacry介质30,15SephadexR凝胶过滤通过小样试验确定了最适离子交换剂以及吸附/等。剂的交换量留有充分的余地。因此层析柱的实际交换量只能是理论交换量的25-50%。在要分别的蛋白质溶液的成分简单，目的蛋白质与杂质蛋白质性质相用下式来计算：AW= B×C×M式中：W—离子交换剂的装柱量，mlA—目的蛋白质的含量mgM—目的蛋白质的分子量Dal

〔1〕B—单位重量的离子交换剂的理论交换当量毫克当量/mlC—系数 一般取5%—50%H=3 400Wπ离子交换层析柱的高径比多为10H=3 400Wπ式中：H—层析柱离子交换剂的装填高度cm—所需交换剂的装柱量〔由式〔1〕求得，π—3.14161则，柱的直径D= H10的体积和待分别蛋白质打算的。流速大小可以用体积流速〔m·c-2h1〕或线所以常用线性流速表示，两种流速的换算关系如下：体积流速〔ml·cm-2·h-1〕线性流速〔cm·h-1〕=层析柱横断面面积〔cm2〕流速过大会降低层析柱的区分力。其最正确值，需试验确定。一般承受 10c·h1。【试验器材】离心管φ10×151ml、5支、吸头、紫外分光光度计、SDS-装置、φ25×300玻璃层析柱、铁架台、木工水平尺、螺动泵、核酸蛋白质检测仪、局部收集器【试验试剂】1．蛋白质溶液为试验六得到的脱区硫酸铵的目的蛋白质溶液；2．20mM磷酸缓冲液pH7.5NaCl的浓度为2M离子交换树脂：弱酸性CMSephadexC弱酸性DEAESephadexA5050ml95%乙醇。【试验方法】层析条件的优化5mlCM-SephadexC-50DEAE-SephadexA-50〔本试验选用后者〕置于一带有螺旋盖的φ10×15试管中添加5ml20mM磷酸缓冲酸pH7.，颠倒试管数次后，将试管直立地放置在试管架上，让凝胶自然沉淀，5ml吸管移去凝胶上部的缓冲液；重复上述洗涤操作10次；离心管中，分别编号为12、3、4、5；500μl脱盐的目的蛋白溶液；400μl200mM磷酸缓冲2MNaClNaCl50mM100mM200mM300mM400mM5—1015min50μl上清，制SDS-样〔一脱盐后的目的蛋白作比照〕清中杂蛋白多，目的蛋白少的一管的盐浓度作为上柱时的洗柱缓冲液。B．洗脱条件确实定将“A”DEAE-SephadexA50Eppendorf200μl；500μl400μlNaClA”NaClA〔6〕操作后，离心除去上清；〔3〕1、2、3、45pH5.8、6.4、6.8、7.58.0的含有于吸附时一样浓度NaCl的磷酸缓冲液1ml，重复A〔6〕~〔8〕操作，观看目的蛋白洗脱状况。〔4〕选择目的蛋白质洗脱量最高的缓冲液作洗脱用缓冲液；装制离子交换层析柱依据测定的目的蛋白质在试验六得到的脱盐蛋白质溶液中的含量和本试验“1”选顶的离子交换剂的吸水量技术出所需层析柱的尺寸；外表的上清以除去微小的颗粒。假设选用的离子交换剂是弱酸性的，则向用水浸泡过的交换剂中假设20.5mol/L30交换剂，直至漂洗水呈中性后，假设0.5mol/LNaOH30NaOH处理，HCl处理。起目的是使弱酸性交换剂带的反离子是Na+，而弱酸性交换剂以Cl-作为反离子，以增加交换剂的交换量。1/2存在，可承受开启出液阀排解。将处理好的交换剂灌注如层析柱中，待交换剂下2-340ml/h随时将剩余的交换剂悬浮液添加到层析柱中，使交换剂装填均匀、无气泡。输液量以调整至40ml/h的蠕动泵向联，翻开柱底出液阀开动蠕动泵，使二倍柱床体积的蒸馏水通过层析柱；关闭蠕动泵，并取下柱顶塞，让柱顶上的蒸馏水的弯月面降至与主厂顶〔1”确定〕留神冲洗柱壁，使粘在柱壁上的样品完全进入柱床；关闭柱底出液阀后，留神讲洗柱液灌注如柱床顶部空间后塞上柱顶塞，并将其与上述蠕动泵相联。翻开柱底出液阀，开动蠕动泵，将2倍柱床体积的洗柱液送入层析柱，洗去未被吸附的杂蛋白；将柱底出液毛细管通过核酸蛋白质检察仪同分部体积已调至1.5ml的部分收集器相联后，将蠕动泵吸液管插入到洗脱液瓶中〔1”确定2洗脱柱床中吸附的目的蛋白质；核算蛋白质检察仪连接的记录器画出的层析