蛋清卵类粘蛋白的分离纯化

蛋清卵类蛋白的分离化一实器1.仪：计恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器层析柱、紫外可见光分光光度计、空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、真干燥箱分析天平2.试：新鸡蛋凝填料、DEAE-32纤素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)丙酮、氯化钠Na、考马斯亮蓝、考马斯亮24蓝、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、二烧基硫酸钠、乙醇、冰醋酸、碳酸氧钠、氯化铁、酸胺3.主溶的配及料处：10%氯酸先称好的TCA总体积2/3的溶,用10调至1.15,后加水至所需体积。pH6.5磷酸冲:先配成倍的母液用时稀释至mol/L;磷氧钠-磷二钠冲(0.02pH25）制法:0.2mol/L磷氢二钠:HP012H071.64mL,31.5mL;220.2mol/L磷二氧钠:NaH31.21g/1000mL;2胰白标液用mol/LHCl配制每次用完再配;BAEE底物冲(内mol/L:用mol/L的Tris-HCl溶解调pH至7.8;mmol/LBAEE物液:mg定至100mL底物缓冲液中,用前配置。SephadexG-25葡聚凝层析料处:称30g用0.02mol/L,磷酸缓冲液500mL热胀h者室温溶胀h脱气后装柱。纤素子换料处理称纤素粉DE-32)10以mLmol/Lmol/LNaCl溶浸泡20min,移到布氏漏斗中抽滤,蒸馏水洗至中(约抽水移至烧杯中再mLmol/LHCl浸然后移至布氏漏斗中抽滤以蒸馈水洗至中(大约pH6.0)最后倒在烧杯中用mLmol/L,磷酸缓冲液浸泡片刻。于真空干燥器内脱装柱。

二实方CHOM粗的备1.1沉杂白取鸡清,加等体积的三氯醋(1.15)溶液这时出现大量的白色沉,拌均匀后在pH酸计上检查pH值此时的pH值应是。若提取液的值离pH3.5±则要用5mol/LNaOH或5mol/LHCl把pH调回到±0.2的范围以内提取液非常粘调要防止局部过酸或过碱。调好pH值,在室温下静置4h以。1.2离去杂白沉待清蛋白完全沉淀后,以r/min心10min弃去沉淀物,上清再用滤纸过滤。以滤除上清液中的脂类物质及其他不溶性物质。1.3冷酮淀CHOM粗收集滤液转移到一个烧杯里。检查滤液的值是否是3.5,若相差较大要调回到3.5放置冰浴中冷却片刻,缓慢加入3倍积预冷丙(放在冰箱的冷藏室预)玻璃棒轻轻揽匀。用塑料薄膜盖尽量减少丙酮的发。在冰浴里放置4以上。1.4离收CHOM粗并残留酮待CHOM全沉淀后,以4000r/min离5min,倾出上清夜。将沉淀物放在真空干燥器,抽气除去残留丙酮。然后用蒸馏水溶解若解浑油,则滤纸除去不溶物即CHOM提液。层柱盐取mL粗提液上柱脱盐(上样量不超过柱床体积的1/6)。用0.02mol/L,pH磷缓冲液平衡并洗脱。收集洗脱峰。维离交法化CHOM将经Sephadex脱的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02mol/L,pH6.5磷缓冲液淋洗去除杂蛋白。流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线。然后改用0.3mol/LNaCl-0.02mol/L,pH磷缓冲液洗脱。并集活性峰。CHOM纯的备4.1透除将上述收集到的溶液全部装入透析袋内馏水进行透析隔段时间更换一次蒸傾

直到用l%AgN03检无氯离子为止。4.2调透液pH及丙沉CHOM纯将透析液转移到烧杯用mol/LHC1调至4.0,后加入3倍体积的预冷丙酮。盖上塑料薄膜在冰浴里静置h以上。4.3CHOM纯的心干待全析出后倾上剩余的沉淀物于r/min心5min弃去上清夜,淀物干燥就得到透明胶状物一CHOM纯。品定纯5.1十二基酸-聚燭胺胶泳(浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%品2mg/mL)溶于上样缓冲液,上样量10uL,缩胶电泳恒压V,离胶电泳恒压120V凝胶用乙醇和冰醋酸固定30min,0.1%考马斯亮蓝R-250染3025%醇和冰醋酸混合液进行脱色。蛋含测以牛血清白蛋白为标准蛋白质,考马斯亮兰法测蛋白质含量。具体操作步骤如:6.1标曲线的绘制取7只干净试管号,并胺照下表所示加入试剂、混匀,室静置3min,第一管为空白在波长下测定读取吸光度值,以光度为纵坐标,各准液浓度为纵坐标绘图得标准曲线。编号

空白27标准蛋白液加入/mL-0.20.30.60.9%NaCl加量mL1.00.90.80.70.60.4考马斯亮蓝染液加入/mL4.04.0