第六章 发酵条件及过程控制

第六章发酵条件及过程控制发酵是一个非常复杂的生物化学变化过程。受很多环境条件的影响，除了培养基等化学因素影响外，还要受pH、温度、氧气、泡沫及杂菌（及噬菌体）污染等物理和生物因素的影响，而这些因素的影响往往是相互联系，相互影响，同时也是动态的。人们就是通过观察和控制这些工艺条件，从而控制和完成发酵过程。第一节发酵过程中PH的变化与控制第二节发酵过程中温度的影响与控制第三节发酵过程中溶解氧的影响与控制第四节发酵过程中泡沫的形成与控制第五节发酵过程中中间补料第一节发酵过程中PH的变化与控制不同种类的微生物对pH的要求是不同的。不同的发酵阶段往往最适的pH也不同。在不同的pH培养基中，其代谢产物往往也不完全相同，在生产中通过调节pH值范围，也可以达到抑制杂菌的生长。pH值在发酵过程中是一个很敏感的因素，因此，要严格控制和调节。一、 pH对发酵过程的影响pH对发酵过程的影响主要表现在下面几个方面：1、 pH值影响酶的活性2、 pH值影响微生物细胞膜可带电荷的状况3、 pH值影响培养基中某些营养物质的分解或微生物中间产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用4、 pH值可以改变培养基的氧化还原条件二、 影响pH变化的因素1、 菌种的特性2、 培养基的配比3、 发酵条件三、 关于发酵过程中pH的调节在实际生产中，调节和控制发酵液pH值的方法应根据具体情况加以选择。常用的方法：1、 调节培养基的原始pH值；2、 在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，从而合理地控制发酵条件；3、 通过补料进行调节；4、 通过加入碳酸钙进行调节（仅在用生理酸性铉盐做氮源时，现在用的不多。）；5、 通过流加氨水方法调节（既调节pH又提供氮源。通常采用自动控制连续流加）；6、 通过流加尿素调节pH值（有规律性可控制）。味精厂普遍采用。第二节发酵过程中温度的影响与控制温度是影响微生物生长和代谢活动的重要因素，严格保持菌种的生长繁殖和生物合成所需要的最适温度，对稳定发酵过程，缩短发酵周期，提高产量，有着重要的意义。一、生长温度与发酵温度1、生长温度一一适合微生物生长的温度为生长温度。一般分为最高、最适以及最低温度。2、发酵温度一一适合微生物代谢产物形成的温度为发酵温度。二、温度对微生物细胞的生长和发酵代谢产物的影响1、 温度对微生物的影响。、在最适温度范围内，微生物生长速度随温度的升高而增加，发酵温度越高，培养的周期就越短。、处于不同的生长阶段的微生物对温度的反应是不同的。2、 温度对微生物细胞内的酶反应的影响。、在适宜的温度内，温度越高，酶反应的速度就越大，微生物细胞的生长代谢加快，产物生成提前。、酶本身很容易因热的作用而失去活性，温度升高，酶的失活也就越快，表现出生物细胞容易衰老，使发酵周期缩短，从而影响发酵过程的最终产物产量。3、 温度可以通过改变培养液的物理性质，间接影响到微生物细胞的生长。如温度通过影响氧在培养液中的溶解氧浓度、氧传递速度等，进而影响到发酵过程。4、 温度影响到细胞的生物合成方向。如生产菌株金色链霉菌合成四环素的发酵过程中、当温度低于30°C，合成金霉素的能力较强；、当温度再升高，合成四环素能力增强；、当温度升到35C，只合成四环素，金霉素合成停止。5、 对于同一微生物细胞，细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同。、青霉素产生菌生长最适30C，产青霉素的最适25C；、黑曲霉生长最适37C，产糖化酶和柠檬酸的最适温度32-34C；、谷氨酸生产菌生长最适30-32C，产谷氨酸的最适34-37C。三、发酵热1、 发酵热的概念（Q发酵）发酵热是将发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称为发酵热。发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发热以及辐射热等。2、 生物热（。生物）微生物细胞在生长繁殖过程中本身产生的大量热称为生物热。3、 搅拌热（Q搅拌）对于机械搅拌通气式发酵罐，由于机械搅拌带动培养液作相应的比较剧烈的运动，造成液体之间、液体与搅拌器等设备之间的摩擦所产生的比较可观的热量。Q搅拌=PX3601P 发酵罐的搅拌功率（kw）3601——机械能转变为热能的热功当量(kJ/kwh)4、 蒸发热(Q蒸发)在通气培养过程中，空气进入发酵罐后就与发酵液进行广泛的接触，除部分氧等被微生物利用外，大部分气体仍旧从发酵液出来，排放至大气中，必然会引起热量的散发，热量将被空气或蒸发的水分带走，这些热量称为蒸发热。Q蒸发=G(I出-I进)G一一通入发酵罐的空气重量流量(kg干空气/h)I出、I进——发酵罐排气、进气的热焓(kJ/kg干空气)5、 辐射热(Q辐射)辐射热是指因发酵罐温度与外环境温度不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热量。辐射热的大小取决于发酵罐内外的温度差的大小，受环境温度变化的影响。6、发酵热的计算发酵热的计算：、Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射、通过测定一段时间内冷却水的流量和冷却水的进、出口温度可计算出发酵热。Q发酵=GXcwX(t2-t1)/V;G—冷却水的流量(kg/h);Cw—水的比热(kJ/kg.°C);t1、t2—分别为冷却水的进、出口温度C；V一发酵液的体积(m3).发酵热的计算：、通过自动控制发酵罐的温度，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测定温度随时间上升的速度，再按下式计算出发酵热：Q发酵=(M1c1+M2c2)XSM1—系统中发酵液的重量(kg);M2一发酵罐的重量(kg);C1一发酵液的比热(kJ/(kg.C))；C2—发酵罐材料的比热(kJ/(kg.C))S一温度上升速度(C/h)四、发酵过程温度的控制和最适温度的选择1、温度的控制、接种后适当提高培养温度，利于孢子的萌发或加快微生物生长、繁殖，此时发酵的温度是下降的，发酵液的温度上升时，应控制在最适生长温度；、主发酵期，温度的控制低于最适生长温度；、发酵过程中，温度适当可高些，可减少杂菌污染；、常用到的设备有热交换设备。2、最适温度的选择、注意根据同一微生物细胞、细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同的特点进行确定；、注意培养基成分和浓度的选择；、参考其它条件灵活掌握第三节发酵过程中溶解氧的影响与控制空气中含有大约20%的氧，除了一些细菌和少数原生动物外，所有其他生物都依赖于分子氧营养。微生物生物氧化是在生物体内进行的，它只能利用溶解于液体中的氧，或叫做溶解氧。氧是很难溶于水的气体，随着温度升高，氧在水中的溶解度还要下降。目前发酵微生物中研究得比较多的是需氧或兼需氧的微生物，在发酵生产过程中，必须给好氧微生物供给适量空气才能使菌体生长并积累代谢产物。一、 发酵过程中需氧因素在发酵过程中，微生物对氧的需要主要取决于以下几种因素1、 生产菌种不同的产品的生产菌种对氧的需要是不相同的。就是同一个菌种的不同菌株对溶氧的需要也是不同的。这是由于不同类的需氧微生物的氧化酶系统和数量不同（包括细胞色素氧化酶、黄素脱氢酶、多酚氧化酶等）。2、 菌体浓度1） 、霉菌、放线菌、发酵初期：菌量少，需氧量不大；、发酵中期：菌量多，需氧量增大，达到最高。、发酵中后期：菌丝增加，粘度增加，氧的溶解度减少，需要加大通风搅拌。2） 、细菌一一单细胞生长繁殖特点，随着菌体浓度增加，氧的溶解速度不减少。3、 菌龄、菌体与发酵代谢产物时期的最适需要氧的量不一致；、根据最后产物的代谢途径中包括的酶系来确定菌体形成和发酵产物形成的需要氧的量。4、 培养基、培养基成分和浓度的改变对菌体摄氧量的影响有显著的影响；、某些消泡油（如植物油）的添加可以被菌体作为碳源利用，提高菌体摄氧量；、化学消泡剂会妨碍氧的溶解，从而影响供氧；、发酵有毒产物的积累（如NH4、CO2）影响对氧的吸收二、 发酵过程中供氧因素对培养液氧的供应，可以认为是为了克服一系列阻力（气膜、气流界面和液膜阻力）而将氧分子从气相传递到发酵液中的过程。1、通风量和空气流速通风量是指以单位时间内通过单位体积（m3）发酵液的空气的体积比来表示（V/V/m或VXVXm）.有两种情况：、在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果；、在空气流速已十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，相反有副作用。如：泡沫的形成、水分的蒸发、罐温的增加、杂菌的增加等。2、 搅拌一般的情况，改变搅拌速度的效果要比改变通气速率大。1） 、有利溶氧的因素、搅拌能把通入的空气打碎成小泡，增加气液接触的有效界面的传递面积，加速氧的溶解速度。、搅拌能使流体增加湍动程度，减少气泡周围的液膜厚度，有利于氧的转移，有利于固液传递中的接触面积增减。、搅拌使液体形成涡流，可延长气泡在培养液内的停留时间，增加了接触时间，有利于氧的溶解。提高了气液混合的效果。、搅拌还可以阻止或减少菌丝结成团块和颗粒，减少菌丝和液体间的扩散阻力，加速热的传递，使罐温比较均匀。、搅拌器组数与溶氧2） 、不利的现象、耗能；、改变菌丝的形态、损伤细胞，菌丝早溶。3、 空气分布管发酵液中常采用空气分布管来分散空气，提高通气效率。4、 培养液的物理性质在发酵过程中，菌体本身的繁殖及代谢可引起发酵液的性质不断改变。这种会引起下述物理特性的改变：、培养液的粘度、菌丝浓度、表面张力、离子强度等等。进而导致显著的影响培养液的氧的溶解速度，降低通气搅拌的效果。5、 发酵罐内液柱高度液柱高度在空气流量和单位液体体积消耗功率不变时，通风效率是随着发酵罐的H/D增大而增大。H一液柱的高度D一发酵罐直径一般以H/D=2-3较好第四节发酵过程中泡沫的形成与控制在微生物的好氧发酵过程中，为了适应微生物的生理特性，并取得较好的生产效果，就需要不断通入大量的无菌空气，同时，为了加速氧在培养基中的溶解度，还必须进行剧烈的搅拌，使空气成为无数的小气泡，以增加气-液的界面，以有利于溶氧和逸出微生物细胞呼吸过程中产生的CO2。再加上发酵液中含有蛋白质、糖和脂肪等容易发泡物质的存在，在通气发酵过程中，将会产生一定量的泡沫。对通气发酵过程来说，产生一定量的泡沫是正常的现象。但是如果过多的持久性泡沫会给发酵过程造成困难，带来很多不利的影响。一、 影响泡沫消长的一些因素1、 过多持久的泡沫对发酵带来的不利影响：、使发酵罐装填系数减少；、造成大量的逃液，导致产物的损失；、泡沫“顶罐”有可能使培养液从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会；、使微生物生长环境发生了改变，影响了微生物群体的效果，增加了非均一性；、影响通气搅拌的正常进行，妨碍呼吸，造成发酵异常，导致最终产物产量的下降；、使微生物提早自溶，又促使产生更多的气泡；、加入消泡剂，对发酵工艺和产物提取带来困难。2、 泡沫产生的原因、外界引进的气液被机械地分散形成；、由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫。3、 泡沫的种类按发酵液的性质不同，分为两种泡沫、发酵液液面上的泡沫、发酵液液中的泡沫、发酵液液面上的泡沫一一这类泡沫所占的比例最大，泡沫与下面的液面之间有能分辨的界线;、发酵液液中的泡沫一一这类气泡分散很细，均匀，较为稳定，泡沫与液体之间没有明显的界限，比例由上而下逐渐增加。二、 泡沫的消除发酵过程中，泡沫的消除和控制主要有化学消泡和机械消泡两种。一）、化学消泡1、 化学消泡的定义与特性化学消泡是一种使用化学消泡剂进行消泡的方法。优点是：、消泡剂来源广泛，效果好；、用量少，作用迅速可靠，、不仅适用于大规模的发酵生产，也适于小规模的发酵生产、实验等。2、 化学消泡的机理由于发酵过程中形成的泡沫原因有很多，化学消泡的机理也就有多种。化学消泡剂是表面活性剂，当把化学消泡剂加入到发酵体系中，由于消泡剂本身的表面张力相对于发酵液来说是比较低的，一旦接触到气泡的表面，将会使气泡膜局部的表面张力降低，力的平衡受到破坏，因而使气泡破裂或合并，最后导致泡沫破裂。3、 常见的化学消泡剂1）、选择化学消泡剂的原则①、化学消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡作用迅速有效;、具有一定的亲水性；、在水中的溶解度必须较小，以保持持久的消泡或抑泡的性能；、对人、畜及微生物细胞无毒性，不影响发酵过程中的微生物生长和代谢，不影响产物提取分离和产品的质量。、不影响氧在培养液的溶解和传递；、来源方便、广泛、价格便宜。2）、常用的化学消泡剂发酵过程中常用的消泡剂有、天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷烃类发酵过程中常用的消泡剂有、天然油脂类一玉米油、米糠油、豆油、菜油、猪油等。、高级醇类一聚二醇、十八醇等、聚醚类一一聚氧丙烯甘油等、硅酮类——聚二甲基硅氧烷等、氟化烷烃类一一潜在的化学消泡剂。4、操作要点、通过机械分散或借助某些载体使消泡剂更易于在发酵液中进行分散；、将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或分散于载体中；、多种消泡剂并用可增强消泡作用。、利用乳化剂增强消泡剂的消泡作用。常用的有吐温-80为乳化剂。二）、机械消泡1、 机械消泡的定义及特性1） 、机械消泡的定义机械消泡是一种物理作用，靠机械强烈振动，压力变化，促使气泡破裂的消泡方法。2） 、特性一一节省原料，减少染菌机会；消泡效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法。2、 机械消泡的种类一一机械消泡的方法有很多种，一种是在罐内将泡沫消除；另一种是将泡沫引出罐外，泡沫消除后，流体再返回罐内。1）、罐内机械消泡①、耙式消泡桨机械消泡耙式消泡桨结构比较简单的罐内机械消泡装置。是装在发酵罐的搅拌轴上，安装时桨上的齿面略高于液面，靠轴的旋转带动来打碎泡沫，直到消泡作用。该装置消泡只是一种简单的消泡措施，消泡作用并不完全，一般当少量的泡沫产生时，耙齿能随时将泡沫打碎；但当有大量泡沫产生时，耙齿就来不及将泡沫打碎，而当泡沫超过耙桨时，就将失去消泡作用。、旋转圆板式的机械消泡旋转圆板式的机械消泡的装置如下图，这种旋转圆板机械消泡装置是设置在发酵罐内的气相中，与发酵液的液面保持平行。圆板旋转的同时将槽内发酵液注入圆板的中央，通过离心力将破碎成微小泡沫的微粒散向槽壁，从而达到消泡的目的。、流体吹入式机械消泡这是一种把空气及与发酵液吹入发酵液吹入发酵罐中形成的泡沫层来进行消泡的方法。、气体吹入管内吸引消泡这是一种把气体吹入液面上部，然后通过在液面上部设置的冲击板冲击反射，吹回到液面，而将液面上产生的泡沫击碎的方法。、冲击反射板机械消泡这是一种把气体吹入液面上部，然后通过在液面上部设置的冲击板冲击反射，吹回到液面，而将液面上产生的泡沫击碎的方法。、超声波消泡原理是将空气在1.5-3.0MPa下，以1-2m/s的速度由喷嘴喷入共振室而直到消泡的作用。这种方法目前仅用于小型发酵过程的消泡，而不适于大规模工业发酵的消泡。、碟片式消泡器机械消泡碟片式消泡器是一种比较新型的机械消泡装置，其结构如下。使用时将消泡器安装于发酵罐的罐顶，使碟片位于罐顶的空间内，用固定法兰与排气口相连，当高速旋转时，进入碟片间的空气中的气泡被打碎同时甩出液滴，返回发酵罐中，而被分离后的气体由空心轴径排气口排出。2）、罐外机械消泡、旋转叶片罐外机械消泡是将泡沫引出罐外，利用装置中的旋转叶片所产生的冲击力和剪切力进行消泡。、喷雾消泡这是一种利用冲击力、压缩力及剪断力来进行消泡的方法，它将水及发酵液等通过适当的喷雾器喷出来达到消泡的目的。、离心消泡是一种将泡沫注入用网眼及筛目较大的筛子做成的筐中，通过旋转产生的离心力将泡沫分散，从而达到消泡的目的。、旋风分离器消泡发酵罐内产生的泡沫通过旋风分离上部进入脱泡器，并与脱泡器下方引入的气体逆向接触使其破碎。这种方法的特点就是泡沫通过旋风分离器等破碎后，再将带微小泡沫的流体导入装有充填物的脱泡器中，以增大液面的表面积，然后，从脱泡器下方吹入气体，使其与流下的流体逆向接触进行较彻底的脱泡。、转向板消泡这种装置中泡沫以30-90m/s的速度由喷头喷向转向板使泡沫破碎，分离液用泵送回发酵罐内，而气体则排出消泡器外。这种消泡装置的优点是设备简单，运转费用较低。第五节发酵过程中中间补料一般发酵生产中的发酵采用的是分批发酵，即一次投料，中间不加养料直到发酵完毕的一种生产方式。这种方式由于养料逐渐消耗完毕，代谢产物越来越多，菌体趋于衰老自溶，因而到了中后期发酵力会渐渐降低。如果采用过于丰富的培养基来延长发酵周期，提高产量，则会由于过高浓度的培养基对微生物的生长繁殖不利，且通气搅拌困难，最终影响产量。而中间补料工艺的采用，可以延长发酵产物的生成，同时推迟菌种的自溶