中药制剂的含量测定

关于中药制剂的含量测定第1页，共111页，2023年，2月20日，星期二2第一节含量测定的目的与意义

中药制剂质量优劣的标准鉴别检查含量测定中药制剂的鉴别是研究某种原料药或成分的存在与否，从而判定药物的真伪中药制剂含量测定是研究某种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的优劣，是质量控制中的一项重要指标。第2页，共111页，2023年，2月20日，星期二3

通过测定制剂中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药制剂的质量，达到临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场的需要。

中药制剂含量测定的意义第3页，共111页，2023年，2月20日，星期二4中药制剂含量测定的特点含量测定内容中药制剂化学药品对象不同组成及成分复杂成分单一供试品溶液制备方法繁琐，大多需要净化分离方法简单成分明确待测成分确定先根据中医药理论选择药味，再综合选择待测成分一般选择主要成分中药制剂与化学药品含量测定区别第4页，共111页，2023年，2月20日，星期二5§1样品的处理样品处理的主要作用释放被测组分，制成稳定试样除去杂质，纯化浓缩试样形式符合测定的要求样品处理的主要步骤1.样品的粉碎2.样品的提取3.样品的分离纯化第5页，共111页，2023年，2月20日，星期二6§1样品的处理样品的粉碎目的——1.取样均匀2.提取完全粉碎设备——粉碎机、研钵、匀浆机※粒度大小合适

样品粉末的分级（过筛）※防止污染或损失

仪器设备洁净

粉尘和较大颗粒的损失。第6页，共111页，2023年，2月20日，星期二7§1样品的处理样品的提取

关键——提取完全溶剂的选择水、酸水、碱水亲水性的有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮亲脂性的有机溶剂：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷

第7页，共111页，2023年，2月20日，星期二8常见的提取方法：

萃取法

浸渍法回流提取法连续回流提取法超声提取法

水蒸气蒸馏法超临界流体提取法

微波辅助萃取法§1样品的处理样品的提取

第8页，共111页，2023年，2月20日，星期二9优缺点及适用范围：优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少缺点：费时（12-24h）费溶剂（10-50倍）§1样品的处理样品的提取（一）冷浸法操作：样品→精密称定→置容器内→精密加入溶剂→称定重量→浸泡（12~24h）→称重→补足重量→测定测定方法：全部测定法：过滤→滤液→蒸干→定容→测定（残渣需洗涤完全）部分测定法：过滤→滤液→取若干体积测定（不适宜挥发性较大的溶剂）第9页，共111页，2023年，2月20日，星期二10采用回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热提取优缺点及适用范围：提取效率高，提取时间短，为0.5～2小时；提取杂质较多，不适用于热不稳定或具有挥发性的成分§1样品的处理样品的提取

（二）回流提取法（三）连续回流提取法万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定+HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定+甲醇，加热回流至提取液无色为止用索氏提取装置，利用遇热易挥发溶剂反复提取优缺点及适用范围：提取效率高，所需溶剂少，提取杂质较少，操作简便；受热易分解的成分不宜使用。第10页，共111页，2023年，2月20日，星期二11§1样品的处理样品的提取（四）超声提取法原理：超声波的助溶作用优点：操作简便，提取速度快※超声波可能引起供试品化学成分的改变※需对超声频率、提取时间、提取溶媒等进行考察第11页，共111页，2023年，2月20日，星期二12§1样品的处理样品的提取

（五）超临界流体提取法（Supercritical-fluidextraction，SFE）超临界流体——特殊的物质状态密度-d液体→溶解能力强粘度-气体→传质快，有利于待测组分的扩散表面张力几乎为0→浸润性能好第12页，共111页，2023年，2月20日，星期二13§1样品的处理样品的提取超临界流体提取法密度受压力、温度的影响大→改变对溶质的溶解能力加入甲醇、氯仿、苯等改变极性→提取不同极性的成分优点：速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，而且可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用。第13页，共111页，2023年，2月20日，星期二14§1样品的处理样品的分离纯化（一）沉淀法样品+沉淀剂杂质沉淀→过滤→取滤液测定待测组分沉淀→重量法或溶解后测定蛇胆糖浆口服液含有大量糖，可用无水乙醇回流样品，冷后过滤，除糖以消除其干扰。

复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。

第14页，共111页，2023年，2月20日，星期二15§1样品的处理样品的分离纯化

（二）蒸馏法适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等最常用水蒸气蒸馏法共水蒸馏法通水蒸气蒸馏法水上蒸馏法利用盐析作用，提高蒸馏效果第15页，共111页，2023年，2月20日，星期二16§1样品的处理样品的分离纯化（三）液-液萃取法直接萃取法萃取剂的选择亲脂性有机溶剂：如苯、氯仿或乙醚弱亲脂性的溶剂：如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱利用盐析作用，提高提取率原理：利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。第16页，共111页，2023年，2月20日，星期二17§1样品的处理样品的分离纯化（三）液-液萃取法离子对萃取法※水相酸度的控制※离子对试剂的选择BH+（水相）+In-(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有机相）生物碱离子对试剂：酸性染料，如BTB,BCG适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取弱极性离子对第17页，共111页，2023年，2月20日，星期二18§1样品的处理样品的分离纯化（四）色谱法（层析法）分离原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法：湿法装柱、干法装柱微柱色谱（固相萃取LSE）第18页，共111页，2023年，2月20日，星期二19§1样品的处理样品的分离纯化LSE常用净化剂（填料）硅胶：酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析，强烈保留碱性化合物。洗脱顺序：极性小→大氧化铝：带有碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、内酯等类型的化合物分离中性、酸性氧化铝：适用于酸性成分的分离第19页，共111页，2023年，2月20日，星期二20§1样品的处理键合相硅胶（C18或ODS）:分开脂溶性和水溶性成分操作程序：①柱的活化；②上样；③清洗；④洗脱洗脱顺序：极性大→小大孔树脂分为极性（丙烯酰胺聚合物）和非极性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型※使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗

第20页，共111页，2023年，2月20日，星期二21§1样品的处理聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。硅藻土、纤维素：亲水型填料，以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相的分配色谱离子交换树脂：用于除去样品中的离子及萃取可离解化合物(弱酸、弱碱药物)活性炭：非极性吸附剂使用前需先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥分开水溶性芳香族物质与脂肪族物质，单糖与多糖，氨基酸与多肽第21页，共111页，2023年，2月20日，星期二22§1样品的处理样品的分离纯化（五）固相微萃取（SPME）

集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法第22页，共111页，2023年，2月20日，星期二23§1样品的处理样品的分离纯化（六）消化法——测定中药制剂中的无机元素湿法消化硝酸—高氯酸法：适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏※对含氮杂环类有机物破坏不够完全

硝酸—硫酸法：与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。硫酸—硫酸盐法：常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。第23页，共111页，2023年，2月20日，星期二24§1样品的处理样品的分离纯化※控制温度在420℃以下※灰化完全，切勿弃去不易溶灰分※不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。灼烧灰化(+Na2CO3/MgO)供试品灰分干法消化第24页，共111页，2023年，2月20日，星期二25§2常用定量分析方法

重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法

一、化学分析法适用于含量较高的成分及无机成分的测定滴定分析法酸碱滴定法沉淀滴定法配位滴定法氧化还原滴定法第25页，共111页，2023年，2月20日，星期二26§2常用定量分析方法重量分析挥发法：又叫汽化或干燥法如水分测定及干燥失重测定萃取法：又称为提取法或抽取法如冰片散中冰片的含量测定沉淀法：如苦参片中苦参总碱的含量测定第26页，共111页，2023年，2月20日，星期二27§2常用定量分析方法滴定分析酸碱滴定法：测定生物碱、有机酸、内酯类

沉淀滴定法银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物四苯硼钠法：+生物碱→白色沉淀亚铁氰化钾法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸铵法）：测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量氧化还原滴定法：酚类、糖类及矿物药中Fe、As等成分的中药制剂；分为碘量法、高锰酸钾法和亚硝酸钠法等第27页，共111页，2023年，2月20日，星期二28§2常用定量分析方法二、紫外－可见分光光度法第28页，共111页，2023年，2月20日，星期二290.575光源单色器吸收池检测器信号处理及显示§2常用定量分析方法紫外－可见分光光度法紫外分光光度计基本构造第29页，共111页，2023年，2月20日，星期二30§2常用定量分析方法紫外－可见分光光度法（一）单波长分光光度法吸收系数法（CHP最为常用）

A=ECL（朗伯-比尔定律：物质对单色光吸收特性与浓度、液层厚度关系定律）对照品比较法对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（100±10％）标准曲线法要求：

选择被测成分的λmax为测定波长，而共存组分在此波长处基本无吸收，并控制供试液的吸收度读数在0.3-0.7之间第30页，共111页，2023年，2月20日，星期二31§2常用定量分析方法吸收系数法测定供试品溶液在规定波长处的吸收度A，根据A=εcl，若l和吸光系数ε或

已知，即可求出被测物的浓度。

例:小檗碱溶液在345nm处的为728，现测的某小檗碱溶液在345nm出的吸收度为0.5824，计算该小檗碱溶液的浓度。第31页，共111页，2023年，2月20日，星期二32§2常用定量分析方法标准曲线法从标准品吸光度-浓度曲线求得样品溶液的浓度

对照品对照法在一定线性范围内根据Lambert-Beer定律溶液的浓度和吸光度存在以下关系第32页，共111页，2023年，2月20日，星期二33§2常用定量分析方法紫外－可见分光光度法（二）计算分光光度法双波长分光光度法（等吸收点法、系数倍率法）三波长法导数光谱法一般应用于供试品溶液中含有2中或2种以上的组分的含量测定。差示光谱法

利用比样品浓度稍低的标准品作为空白,进行测定及计算的方法.第33页，共111页，2023年，2月20日，星期二34ａ为干扰组分的吸收光谱ｂ为待测组分的吸收光谱ｃ为混合组分的吸收光谱关键步骤：选择λ1和λ2的基本条件干扰组分在λ1和λ2处应具有相同的吸收度待测组分在这两个波长处的吸收光度差值应足够大波长(λ1、λ2)双波长法等吸收点法abc计算分光光度法第34页，共111页，2023年，2月20日，星期二35分析步骤①选择双波长（λ1、λ2）②绘制标准曲线

△Ａ对浓度Ｃ作图（回归）样品测定λ1、λ2，分别测定Ａ1及Ａ2△Ａ应用条件：吸收曲线有峰和谷双波长法等吸收点法abc计算分光光度法第35页，共111页，2023年，2月20日，星期二36§2常用定量分析方法紫外－可见分光光度法紫外光谱法中对仪器和试剂的要求（1）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度的准确性、杂散光等。（2）对溶剂的要求：用1cm石英池盛装溶剂，以空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度在220nm—240nm范围内不得超过0.40；在241nm—250nm范围内不得超过0.20；在251nm—300nm的范围内不得超过0.10；300nm以上不得超过0.05。第36页，共111页，2023年，2月20日，星期二37§2常用定量分析方法三、薄层扫描法（TLCS）

薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-t或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。第37页，共111页，2023年，2月20日，星期二38§2常用定量分析方法薄层扫描法（TLCS）1.薄层吸收扫描法

光源：钨灯和氘灯；

灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达ng级；

适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。第38页，共111页，2023年，2月20日，星期二39§2常用定量分析方法薄层扫描法（TLCS）

2.薄层荧光扫描法

光源：氖灯或汞灯;

灵敏度：最低可测到10-50pg;

适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。第39页，共111页，2023年，2月20日，星期二40§2常用定量分析方法四、气相色谱法（GC）

基本原理

气相色谱法（GC）是将气化后的试样由载气（流动相）带入色谱柱，根据各组分在流动相和固定相间作用的不同而分离，并随载气依次流出色谱柱，经检测器检测，利用保留值进行定性，色谱峰面积或峰高进行定量的分析方法。

第40页，共111页，2023年，2月20日，星期二41§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）

基本原理

气-固色谱气-液色谱吸附色谱分配色谱填充柱色谱毛细管柱色谱1.按固定相分3.按柱子粗细分GC分类

2.按分离原理分第41页，共111页，2023年，2月20日，星期二42§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）基本概念

色谱峰：由电信号强度对时间作图所绘制的曲线。（正态分布曲线）

不正常的色谱峰：前延峰、拖尾峰

常用定量参数：峰高、峰面积

常用定性参数：峰位

用于衡量柱效：峰宽

第42页，共111页，2023年，2月20日，星期二43§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）基本概念

基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线，横轴直线。

保留值

保留时间tR保留体积VR

死时间t0死体积V0

调整保留时间t`R调整保留体积V`R

第43页，共111页，2023年，2月20日，星期二44§2常用定量分析方法第44页，共111页，2023年，2月20日，星期二45§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）塔板理论塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好

第45页，共111页，2023年，2月20日，星期二46§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）柱效指标理论塔板数n及理论塔板高度H衡量色谱柱分离效果的参数：理论塔板数n。105-106

在一定高度内，组分可以在两项中达到分配平衡，次高度为理论塔板高度。

第46页，共111页，2023年，2月20日，星期二47§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）柱效指标理论塔板数n及理论塔板高度H

第47页，共111页，2023年，2月20日，星期二48§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）柱效指标

指待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间的分离情况。分离度的计算衡量色谱分离条件优劣的参数第48页，共111页，2023年，2月20日，星期二49§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）适用范围挥发油及其它挥发性组分：冰片、桉叶素、樟脑、丁香酚、龙脑等。中药制剂含水量、含醇量系统适用性试验1.理论塔板数n＝5.54(tR/W1/2)2

※

不得低于最小理论塔板数；柱长，柱填充、载体性能等有影响。

第49页，共111页，2023年，2月20日，星期二50§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）系统适用性试验2.分离度R=2(tR1-tR2)/(W1+W2)

※R≥1.5（两峰完全分离）3.重复性※RSD≤2.0％(n=5)4.拖尾因子

T=W0.05h/2d1(d1峰极大至峰前沿之间的距离)※峰高法定量时1.05≥T≥0.95

第50页，共111页，2023年，2月20日，星期二51§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择一、固定相的选择气-液分配色谱柱固定液的选择按相似相溶原则选择按组分性质的主要差别选择

第51页，共111页，2023年，2月20日，星期二52§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）按相似相溶原则选择固定液与被测组分极性“相似相溶”非极性组分—选非极性固定液，按沸点顺序出柱，低沸点的先出柱中等极性组分—选中等极性固定液，基本按沸点顺序出柱强极性组分—选极性固定液按极性顺序出柱，极性强的后出柱第52页，共111页，2023年，2月20日，星期二53§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）按组分性质的主要差别选择组分以沸点差别为主—选非极性固定液按沸点顺序出柱、沸点低的先出柱组分的极性差别为主—选极性固定液按极性强弱出柱、极性弱的先出柱例：苯（80.10C），环己烷（80.70C）选非极性柱——分不开；选中强极性柱——较好分离，环己烷先出柱第53页，共111页，2023年，2月20日，星期二54§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择一、固定相的选择2.气-固分配色谱柱固定相的选择吸附剂：活性炭（非极性）硅胶，Al2O3（极性，吸附力强）分子筛：吸附+分子筛高分子多孔微球：GDX有机合成高分子聚合物、吸附+分配机制

第54页，共111页，2023年，2月20日，星期二55§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择二、柱温的选择

沸点℃固定液配比%柱温℃高（300-400）低1-5200-250200-3005-10150-180100-20010-15平均2/3低高15-2550以下根据样品的沸点选择第55页，共111页，2023年，2月20日，星期二56§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择三、载气的选择柱效、柱压、灵敏度流速20-80mL/min低流速氮气*高流速氢气氦气热导检测器氢气氦气氢焰检测器、电子捕获检测器氮气

第56页，共111页，2023年，2月20日，星期二57§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择四、其他条件气化室（进样口）温度：不超过沸点50℃高于柱温30-50℃检测室温度：高于柱温30℃左右进样量：

气体0.1-1mL液体0.2-1μL

第57页，共111页，2023年，2月20日，星期二58§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）实验条件的选择五、检测器热导检测器（TCD）氢焰离子化检测器（FID）氮磷检测器（NPD）电子捕获检测器（ECD）

第58页，共111页，2023年，2月20日，星期二59§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法峰面积的测量正常峰不对称峰自动求和（自动积分仪或色谱工作站）：直接给出A，h，W1/2

第59页，共111页，2023年，2月20日，星期二60§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法

归一化法外标法校正因子内标法标准溶液加入法常用的定量分析方法第60页，共111页，2023年，2月20日，星期二61§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法定量校正因子

第61页，共111页，2023年，2月20日，星期二62§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法绝对校正因子

第62页，共111页，2023年，2月20日，星期二63§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法相对校正因子

第63页，共111页，2023年，2月20日，星期二64§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法校正因子内标法校正因子的计算取内标物和待测组分的对照液进样测定A取含有内标物的供试品溶液进样测定A

第64页，共111页，2023年，2月20日，星期二65§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法

对内标物的基本要求1.内标物是原样品中不含有的组分2.内标物的保留时间应与待测组分相近，但彼此能完全分离(R≥1.5)3.内标物必须是纯度合乎要求的纯物质第65页，共111页，2023年，2月20日，星期二66§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法

内标法的优缺点优点定量结果与进样量的重复性无关与其他组分是否出峰无关用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量测定的结果较为准确缺点操作程序较为麻烦寻找合适的内标物有困难第66页，共111页，2023年，2月20日，星期二67§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法归一化法前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰依据：组分含量与峰面积成正比

第67页，共111页，2023年，2月20日，星期二68§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法外标法

以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法a工作曲线法b外标一点法c外标两点法

第68页，共111页，2023年，2月20日，星期二69§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法外标法

b外标一点法一种浓度对照物对比样品中待测组分含量前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近

第69页，共111页，2023年，2月20日，星期二70§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法外标法

c外标两点法

前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度

外标法特点：

1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰

2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大→每次进样量应一致，否则产生误差第70页，共111页，2023年，2月20日，星期二71§2常用定量分析方法气相色谱法（GC）定量分析方法标准溶液加入法精密称量被测组分的对照品，配置成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，依据内标法或外标法测定含量，再扣除加入对照品的含量，即得。

第71页，共111页，2023年，2月20日，星期二72§2常用定量分析方法五、高效液相色谱法（HPLC）特点：高柱效、高灵敏度、高选择性、分析速度快及应用范围广适用于测定 挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋白质、氨基酸、生物碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类。第72页，共111页，2023年，2月20日，星期二73§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）基本原理以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。1.塔板理论2.速率理论

第73页，共111页，2023年，2月20日，星期二74§2常用定量分析方法项目HPLCLC柱长/cm10-25100-200内径/mm2-1010-25压力/MP2-200.001-0.1柱效/n/m2*103-5*1032-50进样量/g10-6-10-21-10分离、分析时间/h0.05-1.01-20装置自动化手工检测方法检测器检测收集后定性定量HPLC与LC的比较：第74页，共111页，2023年，2月20日，星期二75§2常用定量分析方法项目HPLCGC进样方式溶液气化或裂解流动相液态气态压力/MP2-200.1-0.5柱温常温常温-300℃分离原理吸附、分配、离子交换、化学键合吸附、分配应用范围大部分物质易挥发、热稳定HPLC与GC的比较：第75页，共111页，2023年，2月20日，星期二76§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择色谱柱的选择①大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；②解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；③脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。第76页，共111页，2023年，2月20日，星期二77§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择流动相的选择反相键合相色谱常用流动相：

流动相常用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药物非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃等用于分离疏水性物质缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特性的化合物第77页，共111页，2023年，2月20日，星期二78§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择流动相的选择正相键合相色谱：①常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；②常采用二元以上的混合溶剂系统。

第78页，共111页，2023年，2月20日，星期二79§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择洗脱方式等度洗脱：同一分析周期内流动相的组成保持恒定，适用于组分数较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和pH值等），适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品，使所有组分在适宜条件下获得分离。

第79页，共111页，2023年，2月20日，星期二80§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择检测器UV或UVD：被测物有紫外吸收，流动相的截止波长小于检测波长。FD：灵敏度高，荧光物质检测。ELSD：挥发性低于流动相的组分，糖类、高分子化合物等；不能用含盐流动相。ECD、RID、CLD等

第80页，共111页，2023年，2月20日，星期二81检测器特点最低检测限适用范围紫外检测器（UV或UVD）:①可变波长型②二极管阵列检测器①检测有紫外吸收的物质;②灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱.10-7-10-12g用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基及其化合物等荧光检测器(FD)①用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质;②灵敏度高于紫外检测器1×10-10g/ml用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等蒸发光散射检测器(ELSD)①属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相的任何样品组分;②检测灵敏度较低,适用于流动相能挥发的色谱洗脱,不能用含缓冲盐的流动相用于检测糖、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物第81页，共111页，2023年，2月20日，星期二82电化学检测器(ECD)用于能氧化、还原的有机物质的检测，尤其适用于痕量组分的分析1×10-12g/ml适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等示差折光检测器(RID)①通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测.②稳定性好,操作方便.③灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动的影响大,不适合梯度洗脱10-8g/ml尤其适合于糖类的检测化学发光检测器(CLD)①高选择性、高灵敏度的新型检测器.②设备简单,自身发光,无需光源,价格便宜Pg级(10-12)用于分析微量脂质、核酸、生物胺等第82页，共111页，2023年，2月20日，星期二83§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择HPLC前处理流动相的处理：①溶剂的纯化：色谱纯；②流动相脱气：常用超声波振荡脱气；③过滤：防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，采用0.45μm以下微孔滤膜过滤，滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。第83页，共111页，2023年，2月20日，星期二84

高效液相色谱法（HPLC）实验条件的选择HPLC前处理样品的处理：①待测组分的提取②溶剂的挥发：自然挥散或在氮气流下吹干，适用于小体积样品和挥发性溶剂；减压蒸发，适用于热不稳定样品；冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。③滤过：样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。

§2常用定量分析方法第84页，共111页，2023年，2月20日，星期二85§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）HPLC法分类及方法分类一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）

第85页，共111页，2023年，2月20日，星期二86§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）一、液固吸附色谱法（LSC）

固定相：硅胶、薄膜型氧化铝、聚酰胺、高分子多孔小球等。

流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、烷烃等。

出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱。

第86页，共111页，2023年，2月20日，星期二87§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）二、液液分配色谱法（LSC）

固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）内压大、易流失、不实用

正相色谱—固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱;适于分离极性组分

反相色谱—固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱;适于分离非极性组分

第87页，共111页，2023年，2月20日，星期二88高效液相色谱法（HPLC）三、化学键合相色谱法（分配+吸附）

基本原理：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面。

特点：不易流失、热稳定性好、化学性能好、载样量大、适于梯度洗脱。

§2常用定量分析方法化学键合相色谱法分类反相键合相色谱法正相键合相色谱法离子对色谱法离子抑制色谱法第88页，共111页，2023年，2月20日，星期二89

高效液相色谱法（HPLC）反相键合相色谱法固定相：多采用非极性键合相，C18柱（ODS）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水基础溶剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF

流动相极性>固定相极性出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱

适用：非极性-中等极性组分

§2常用定量分析方法第89页，共111页，2023年，2月20日，星期二90

高效液相色谱法（HPLC）正相键合相色谱法固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱

适用：氰基键合相与硅胶柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似；氨基键合相有较强氢键结合能力，氨基柱作分析糖类的专用色谱柱

§2常用定量分析方法第90页，共111页，2023年，2月20日，星期二91

高效液相色谱法（HPLC）离子对色谱法（PIC或IPC）直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物，分为正相和反相离子对色谱法，重点介绍反相离子对色谱法。

§2常用定量分析方法①基本原理:以C18或C8键合相为固定相，用含离子对试剂的有机溶媒-水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物.第91页，共111页，2023年，2月20日，星期二92

高效液相色谱法（HPLC）离子对色谱法（PIC或IPC）

②适用范围:适用于有机酸、碱、盐的分离；用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离;在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸的分析。③缺点:离子对试剂价格比较贵。

④分离条件的选择:离子对试剂的性质和浓度、流动相的pH值及流动相中所含有机溶剂的种类与比例等。

§2常用定量分析方法第92页，共111页，2023年，2月20日，星期二93

高效液相色谱法（HPLC）离子抑制色谱法（ISC）通过向流动相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ISC）。特点:该方法简便、经济实用、分离效果好，在许多场合可替代离子对色谱法，但重复性较差是其缺点。适用范围:通常用于反相色谱中，适用3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱碱和两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。

§2常用定量分析方法第93页，共111页，2023年，2月20日，星期二94高效液相色谱法（HPLC）离子抑制色谱法（ISC）

离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别：①离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂，调节pH值，抑制样品组分的解离，使其以分子形式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂，并调节pH值使样品组分尽可能呈解离状态，使离子对试剂的反离子与样品离子结合成中性离子对。②离子抑制色谱仅适用于弱碱、弱碱的分离，不适用于有机强酸、强碱的分离；而离子对色谱法对不同强度的酸、碱均适用。

§2常用定量分析方法第94页，共111页，2023年，2月20日，星期二95§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）定量分析方法一、外标法（同GC）二、内加法

将待测物的纯品加入待测样品溶液中，通过测定该纯品加入前后组分峰高或峰面积的变化进行含量测定的方法。

第95页，共111页，2023年，2月20日，星期二96§2常用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）定量分析方法二、内加法该法不需内标物，又具有内标法的优点第96页，共111页，2023年，2月20日，星期二97§2常用定量分析方法荧光分析法法本身具有荧光或能转化为荧光的物质，如胺类、甾体、蛋白质、氨基酸和酶等原子吸收分光光度法

呈原子状态的金属和部分非金属。中药材中重金属、毒害元素、微量元素等

第97页，共111页，2023年，2月20日，星期二98荧光物质分子都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱，是荧光分析中定性与定量的依据和基本参数。乙醇溶液中蒽的激发光谱和荧光光谱荧光分析法荧光分析法(Fluorime-try)是根据荧光强度测定物质含量的定量方法。§2常用定量分析方法第98页，共111页，2023年，2月20日，星期二99特点：灵敏度高、选择性好、试样量少可提供较多荧光参数(激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光寿命等)具有天