黄瓜种质PI200815抗白粉病基因定位研究,农艺学论文

黄瓜种质PI200815抗白粉病基因定位研究,农艺学论文本篇论文目录导航：【题目】【报道对黄瓜白粉病抗病基因进行了遗传分析和定位研究，研究结果也各不一样。PI200815是一份起源于缅甸的抗白粉病种质材料，kooistra〔1968，1971〕对其抗性进行了遗传分析，以为其抗性由隐性单基因控制，截至到当前为止，尚未有关于这份抗病种质中抗病基因的定位研究。本实验利用PI200815与一份感病材料〔新泰密刺选系931〕进行杂交、自交构建遗传分离群体，对其抗病基因进行了遗传分析和定位研究。2.1材料与方式方法2.1.1实验材料本实验所采用的研究材料由中国农科院蔬菜花卉所黄瓜课题组提供，母本P1为高抗白粉病的纯合自交系PI200815，果肉呈橙黄色，对白粉病表现为抗病。父本P2是从栽培种新泰密刺中选育出的纯合自交系931，属于典型的华北类型黄瓜，对白粉病表现为感病。以P1、P2为亲本进行杂交，F1自交得F2，收获186个F2单株，F2继续自交获得F3家系。2.1.2白粉病抗病性鉴定2.1.2.1材料准备抗病鉴定于2020~2020年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室内进行。实验材料包括双亲、F1、F2及其F2:3家系〔186份〕。鉴定在3个季节进行：2020年春季利用病圃对F2进行成株期田间自然发病抗病鉴定〔2020S〕，2020年春季对F2：3家系进行苗期人工接种抗病性鉴定〔2020S〕以及2020年秋季对F2：3家系进行人工接种抗病性鉴定〔2020A〕。在实验2020S中，将186个F2单株育苗后定植于温室中。在实验2020S和2020A中，将F2：3家系直接播种于营养钵内，分三次重复，每重复5株，随机区组排列。2.1.2.2菌源制备白粉病苗期人工接种鉴定采用孢子悬浮液喷雾的接种方式方法。采集自然发病的黄瓜白粉病病株上的新发生的病叶，用毛刷刷取叶片典型病斑上的孢子〔单丝壳白粉菌Sphaerothecafuliginea〕于盛有无菌水的烧杯中、过滤，参加SDS〔1g/mL〕，高速搅拌10分钟，用血球记数法统计浓度，制备成浓度为5105/mL的孢子悬浮液，用于接种。2.1.2.3接种、管理方式方法在实验2020S中，采用病圃〔该温室连年种植黄瓜，白粉病发生严重〕田间鉴定，田间常规管理，所以无需进行人工接种，待其自然发病后，调查每株第3~8片真叶的病情级别，计算病情指数。在实验2020S和2020A中，幼苗于第三片真叶展平常，进行喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮液均匀地喷于黄瓜叶片上，以叶片正反面有水滴流淌为度。接种后黑暗保湿〔相对湿度为78%~80%〕12~16小时，之后天天光照14小时，并不再保湿，温度一般控制在白天：25℃~28℃，晚上：20℃~22℃之间。2.1.2.4病情调查和数据处理接种15d后调查发病情况。根据接种叶片上的发病情况进行病情评级，评级标准见表1，计算病情指数〔DI〕。病情指数计算方式方法：病情指数=〔每个病级的植株数级别数〕/〔总植株数最高级别数〕100，F2：3家系最终病指取三次重复的平均值。黄瓜白粉病病情分级标准：0级：无病斑1级：病斑面积小于叶片面积1/33级：病斑面积大约介于叶片面积1/3~2/35级：病斑面积大于叶片面积2/3，病斑连成片7级：白粉覆盖整个叶片，叶片开场变黄9级：叶片变褐，开场部分坏死，叶缘上卷黄瓜白粉病群体抗性分级标准：高抗〔HR〕：0＜病情指数15；抗病〔R〕：15＜病情指数35；中抗〔MR〕：35＜病情指数55；感病〔S〕：55＜病情指数80；高感〔HS〕：病情指数＞80对三次实验调查的病情指数进行整理分析，用MicrosoftExcel2003计算遗传参数并绘制频数分布图，分析后代分离规律，2.1.3构建SSR连锁图谱。2.1.3.1黄瓜基因组DNA的提取2.1.3.1.1黄瓜材料的准备采集双亲、F1和所有F2单株叶片，提取其基因组总DNA放于-20℃冰箱内暂时储存，把各份材料在冷冻枯燥机中进行枯燥处理(约24h)，冻干后将其搓成粉末，封口，放入低湿度储存柜内保存，待用。2.1.3.1.2DNA提取采用改进CTAB法提取样品全基因组DNA，详细操作步骤见附录22.1.3.1.3基因组DNA浓度的检测。采用琼脂糖凝胶电泳对DNA浓度进行检测，详细操作步骤见附录22.1.3.2SSR标记分析。2.1.3.2.1SSR标记来源基于国际黄瓜基因组测序计划设计的2112对SSR引物〔任毅,2018〕。上述引物均由上海生物工程公司合成。用亲本对所有SSR引物进行挑选，完成后得到的多态性引物用于构建遗传图谱。2.1.3.2.2亲本挑选多态性SSR引物首先用2112对SSR引物对双亲对进行挑选，找出具有多态性的引物。用所有在双亲上表现出多态性的引物对F2群体进行SSR分析，构建遗传图谱，SSR反响体系和程序见附录22.1.3.2.3凝胶电泳检测。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶〔PAGE〕对PCR产物进行电泳检测〔凝胶浓度为6%〕，显色采用银染法，详见附录2。2.1.3.2.4PCR扩增结果统计根据作图软件〔JionMap4.0〕的使用讲明，对电泳条带进行统计和数据整理，详细方式方法见附录2。2.1.3.3SSR连锁群的构建构建连锁群所使用的软件为JoinMap4.0，先把Excel表中的原始数据进行处理，转化成软件中F2群体所需格式，然后进行数据的处理和分析，详见附录2。2.1.4黄瓜白粉病抗病基因的QTL分析把整理好的F2或F2:3家系的表型调查结果用Excel整理，把其改为*.qua文件格式保存。整理JoinMap4.0作图软件的结果，把两者结果相相结合，采用MapQTL4.0软件分析，以复合区间作图法(MQM)分别按不同季节进行白粉病抗性相关基因的QTL定位。详见附录22.1.5主要试剂、仪器设备。实验中所用到的试剂和仪器参见附录32.2PI200815抗病基因定位结果与分析2.2.1遗传群体抗病性鉴定结果2020年春，对双亲及186株F2群体进行田间成株期抗病性鉴定〔2020S〕。结果显示，抗病亲本P1的病情指数为2.7，表现为高抗；感病亲本P2的病情指数为59.3，表现为感病；F1的病情指数为38.7，介于双亲之间。F2群体中病情指数呈现连续分布，这表示清楚，抗病亲本中含有的抗白粉病性状可能是由数量基因控制。2020年春和2020年秋，对双亲和186株F2对应的的后代F2：3家系进行了苗期人工接种抗病性鉴定〔2020S和2020A〕，在2020S中双亲鉴定结果与F2结果基本一致，感病亲本P2病情指数到达52.3，表现为感病，而抗病亲本为2.4，仍然表现为高抗。在实验2020A中，结果类似。表2.1P1、P2、F1、F2和F2：3家系三次抗病性鉴定病指分布图2.1F2或F2：3群体病情指数分布图2.2.2SSR多态性分析采用PAGE技术挑选在双亲间表现为多态性的引物，从黄瓜基因组测序后开发的2112对SSR引物有中129对引物在两亲本间有多态性且扩增条带清楚明晰的引物，部分SSR引物在亲本间的扩增情况见图3.2。图2.2SSR引物在亲本P1〔PI200815〕和P2〔931〕间的扩增结果2.2.3遗传图谱的构建将挑选出的129对引物，在F2群体上进行扩增分析并用Jionmap软件构件连锁图谱。获得了一张包含8个连锁群的遗传图谱，可与黄瓜7条染色体逐一对应〔华而不实两条连锁群均对应到3号染色体上〕。这个遗传图谱公包含129个SSR标记。这张遗传图谱的总长度为857.9cM，标记间的平均遗传距离为6.65cM。表2.2中列出每条染色体上标记的分布情况。表2.2遗传图谱上SSR分子标记分布情况图2.3黄瓜F2群体SSR遗传图谱2.2.4黄瓜抗白粉病QTL定位分析我们利用三年的抗性鉴定结果和构建的遗传图谱，利用JionMap4.0的复合区间作图法作图法〔MQM〕，对白粉病抗性基因进行了QTL定位分析，结果如下：2020S中，分别在黄瓜Chr1、Chr6上检测到1个QTL位点：pmQTL1.1和pmQTL6.1，pmQTL1.1的LOD值为4.6，表型解释率为10%；其位于标记SSR03860-SSR14445之间，两侧翼标记之间的遗传距离为2cM。pmQTL6.1的LOD值为3.31，表型解释率为7%，其位于标记SSR18251-SSR01148之间，两侧翼标记之间的遗传距离为7.3cM。2020S和2020A中，只检测pmQTL1.1，LOD值分别到达了15.3和4.9，表型解释率分别为37.9%和21.6%〔详见表2.3〕。表2.3：三次实验对白粉病抗性的QTL定位结果综合表中数据能够看出，只要pmQTL1.1这个QTL位点能够被重复检测到。且LOD值较高，即可信度较高，表型解释率也到达了37.9%。pmQTL6.1只要在成株期〔2020S〕抗性鉴定的结果中检测到。图2.4黄瓜白粉病抗性基因的QTL定位图2.5白粉病抗性基因的QTL分析(坐标轴上的线改用黑色)2.2.5主效QTL区域基因预测利用黄瓜全基因组测序〔Huangetal.，2018〕提供的基因组预测、注释结果，对黄瓜白粉病抗性相关的主效QTL〔pmQTL1.1〕所在区域进行了序列比对和分析。发现目的区域两侧翼标记分别为SSR03860和SSR14445，他们直接的物理距离为689Kb，共有95个预测基因。华而不实包括：转录因子，细胞分裂周期蛋白，糖类转运蛋白，脱氢酶，超氧化物歧化酶等多种功能的基因，华而不实还有10个基因与抗性直接相关：2个NBS-LRR类型抗病蛋白，5个紧挨着的抵御素类似基因，2个逆境调控的蛋白，1个调控植物细胞程序性死亡的基因。〔详见表2.4〕表2.4黄瓜白粉病幼苗抗性相关基因的预测结果2.3讨论黄瓜是全世界范围广泛栽培的一种蔬菜，白粉病是黄瓜生产上重要的病害，常造成严重的经济损失，所以国内外专家学者对黄瓜白粉病抗病基因进行了众多研究。在遗传分析方面存在众多不同的观点。造成这种现象的主要原因可能有下面几点：1、专家学者选用的研究材料本身抗病基因不同。例如Kooistra〔1968〕经遗传分析以为Natsufushinari中含有两个白粉病抗性基因，而PI200815中含有第三个抗白粉病基因。2、不同学者研究时所采用的抗病鉴定方式方法不同，如环境的温度湿度不同、病情调查方式方法不同等。3、白粉菌的生理小种不同。本实验通过抗感双亲构建遗传群体，并且构建了覆盖全基因组的遗传图谱，对白粉病抗性基因进行QTL定位研究，在三个季度实验中，检测到一个稳定的主效的QTL位点，表型解释率最高到达了37.9%，LOD值也到达15.3。Kooistra〔1968〕曾报道以为PI200815中白粉病