微生物工程基因工程菌的培养

第八章基因工程菌的培养基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的表现基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：

结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失

分配不稳定性

整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制

受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解

外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序

重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因

受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制

受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解

外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序

重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因

受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌的稳定性

重组质粒逃逸的原因有：

高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧

影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择

遗传特性宿主的选择外源基因是否整合到宿主染色体上

培养基生长速率

发酵工艺限制性基质温度

pH和溶氧外源基因表达基因工程菌的稳定性

提高基因工程菌稳定性的策略

改进载体受体系统以增加质粒稳定性为目的的构建方法有：

将R1质粒上的parB

基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞

基因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力

根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素

药物和食品生产时禁止使用抗生素

加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力

载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高

提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略

分阶段控制培养

因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。

提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略优化基因工程菌的培养工艺培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定

提高质粒稳定性的方法

提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略固定化

固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的发酵工艺

基因工程菌的培养基因工程菌发酵的基本操作方式有：

分批培养

分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限

半连续培养（补料分批）在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物

连续培养不断地流加营养，并不断地取出发酵液。

连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。

固定化培养基因工程菌培养方式补料分批培养补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。基因工程菌培养方式连续培养连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。

但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。基因工程菌培养方式固定化培养基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。基因工程菌的培养方式发酵罐的组成部分有：发酵罐体保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置残留气体处理装置参数测量与控制系统（如pH、O2、CO