临床检验学：临床微生物学检验与临床

临床微生物学检验与临床

临床病例分析1.某男，69岁，2010年5月20日因颈椎骨质增生在某三甲医院手术。术前检查各项相关指标均正常。5月23日检查：WBC及其他各项血液学指标均正常，无感染征象。可是病人在被连续6天大剂量使用广谱三代头孢菌素——头孢唑肟后，病情急剧恶化，腹泻得不到控制，每日蛋花样水样便腹泻十余次，伴阵发性腹绞痛并高热不退。连续三次血培养；三次大便培养均未检出病原菌。5月28日，出现肺部感染。5月29日呼吸衰竭。5月30日因呼吸衰竭、多器官功能衰竭而死亡。死后尸检检测艰难梭菌A&B毒素(CDAB)为强阳性。结论：艰难梭菌感染性肠炎并致肺部感染，最后导致呼吸衰竭、多器官功能衰竭而死亡。医疗鉴定结果：院方“抗生素使用欠合理”，使患者出现菌群失调及肺部感染，最终导致呼吸衰竭、多器官功能衰竭并未及时检出病原体及毒素。病人的死亡“属于一级甲等医疗事故”。临床病例分析2.

患者高XX，男，54岁，2009年3月16日因颈椎病变入某院进行手术治疗，术后长期使用帕珠沙星，头孢孟多酯钠。3月22日出现腹泻，每日十余次，水泻，

呈蛋花样便，伴阵发性腹绞痛，腹胀，高热，体温38-40℃。周围血象：WBC16.0×109

，RBC3.36×1012，大便常规培养无菌生长，急查电解质：钠、氯、钙、磷均低于正常值；

26日检测艰难梭菌A&B毒素(CDAB)为强阳性，临床诊断为艰难梭菌感染性肠炎；立即停用抗生素，改用甲硝唑口服和铬酸梭菌活菌片，并纠正水、电解质紊乱；29日体温正常，4月1日腹泻停止，大便常规检查正常，外周血象WBC10.1×109，RBC3.38×1012

4月2日复查艰难梭菌A和B毒素，阴性显示，痊愈出院。一、临床微生物学检验的概念和任务

临床微生物学检验是检验医学中的一个重要学科。它主要通过人工培养的方法，将各类病原微生物从病人体内分离出来，加以鉴别鉴定并进行药敏试验，从而为临床诊断、治疗和预后判断提供可靠试验依据的实验诊断技术。

临床微生物学检验的主要任务是：1、研究感染性疾病的病原体特征，确定病原微生物；2、提供快速、准确的病原学诊断；3、指导临床合理使用抗菌药物；4、对医院感染进行监控；5、提供重大疫情信息（细菌战、生物恐怖袭击、重大疫情信息）。二、临床微生物学的发展和应用现状临床微生物学的发展和应用现状是一对矛盾的主题（一）、临床微生物学的发展令人瞩目1、临床微生物检验新技术发展迅速随着现代科学技术的不断发展，特别是细胞学、免疫学、生物化学、分子生物学等的不断发展，对微生物学的发展起到了极大的推动作用。传统的细菌分离、培养及生化反应技术，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。新的微生物诊断技术和方法已广泛用于多个领域。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，这些新的微生物学诊断技术能够成功应用于临床的主要有：（1）、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶或其他代谢产物，按酶和产物的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。传统的细菌酶触反应的培养基有两个：EMB(EosinMethyleneBlue)培养基S、S（SalmonellaandShigella）agar

大肠埃希氏菌和伤寒沙门氏菌在SS琼脂上的菌落特征现在的发展（2）、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术在细菌诊断中利用免疫学的各种方法简化了病原微生物的鉴定程序，因而日益受到人们的极大关注。①．抗血清凝集技术早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，被广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、志贺氏菌属、霍乱弧菌等。②．乳胶凝集实验将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7③．荧光抗体检测技术是用于快速检测细菌的免疫学检测技术。在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。可快速、直观地检出样品中少量的病原菌。④．协同凝集试验（COA）

业已证实，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段的活性。近年来国内外学者采用抗体致敏的SPA检测细菌即协同凝集试验。如Rahman等用协同凝集试验鉴定霍乱弧菌O1群的初代分离物做快速筛选，比常规法节省时间。它对颗粒性抗原和可溶性抗原都有相同的作用。对204份材料用两种方法比较表明协同凝集试验具有较高的特异性和敏感性。⑤．酶联免疫测试技术

酶联免疫技术的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验。如双抗体夹心法做快速细菌鉴定。应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本。其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在4—8小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。（3）、分子生物学技术在检测病原微生物中的应用

随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针(Nuclearacidprobe)和聚合酶链反应(Polymerasechainreaction)以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于病原菌的检测和细菌的分类鉴定。①．核酸探针将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子叫核酸探针或基因探针。核酸探针的应用：用于检测无法培养，不能用作生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素。用于检测同食源性感染有关的病毒病，如检测肝炎病毒，流行病学调查研究，区分有毒和无毒株。检测细菌耐药基因。分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。细菌分型，包括rRNA分型。

②.聚合酶技术（PCR）的应用PCR技术原理所谓PCR反应，及时将已经某些标记物标记的特定微生物的DNA片段加入反应系统作为引物，通过聚合酶的作用，对靶DNA进行扩增使其达到足够的检测量，从而对微生物进行分析鉴定的分子生物学技术。PCR建立在三步重复发生反应的基础上。PCR原理图临床案例：变异后的金黄色葡萄球菌的鉴别诊断：金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因，一个是葡萄球菌核酸酶（Stapnylococcalnuclease，SNase），命名为nuc1，另一个是耐热核酸酶（Thermonuclease，TNase），命名为nuc2，其中后者是金黄色葡萄球菌的独有基因。因此，检出变异菌种的nuc2编码基因，即可鉴定变异后的金黄色葡萄球菌。当然PCR也存在缺点，主要是系统容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增。另外试验中需要一定的特殊设备和熟练的操作技术。③、基因芯片技术基因芯片是最重要的一种生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。这将是继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命。

（4）、病原微生物的自动化检测系统近年来，随着计算机技术的不断发展，对病原微生物的鉴定技术朝着微量化、系列化、自动化的方向发展，从而开辟了微生物检测与鉴定的新领域。最有代表性的是法国梅利埃VITEK微生物自动分析系统。VITEK2能鉴定的杆菌种类为135种(包括阴性杆菌和阳性杆菌),

能鉴定的酵母菌种类为54种,

能鉴定的奈瑟,嗜血杆菌为26种。

能鉴定的球菌种类为115种(包括阳性球菌和阴性球菌),

VITEK2还能自动检测抗菌药物对感染菌的MIC，并能对耐药菌株的变迁情况进行自动的统计和分析。

VITEK2的细菌鉴定最快两个小时,平均6个小时出鉴定结果；

药敏试验最快四个小时,平均8个小时出药敏结果.

（5）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）的临床应用该系统包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）和蛋白质指纹数据库，具有快速简便的工作流程和强大可靠的数据处理能力，是微生物鉴别与分类中的最新技术。

1）几个相关概念①离子源（Ionsource）离子源是使中性原子或分子电离，并从中引出离子束流的装置。它是各种类型的离子加速器、质谱仪、电磁同位素分离器、离子注入机、离子束刻蚀装置、离子推进器以及受控聚变装置中的中性束注入器等设备的不可缺少的部件。②质荷比（mass-to-chargeratio）

指带电粒子的质量与所带电荷之比值。以m/z表示，是质谱分析中的一个重要参数。不同m/z值的粒子在一定的加速电压V和一定磁场强度E下，所形成的一个弧形轨迹的半径r与m/z成正比。eeee③基质辅助（Matrix-Assisted）基质辅助是将生物大分子与一特定的基质分子混合形成的共结晶薄膜。结晶将菌落涂在靶板的点位上加1µl基质(CHCA)

干燥形成结晶标本蛋白包埋在基质中+④激光解吸电离（LaserDesorptionIonization）问题：解析OR解吸？离子探测器++++++靶板基质／样品加速区飞行时间环形电极⑤飞行时间质谱仪（TimeofFlight-MassSpectrometer,TOF-MS）在一定的条件下，不同的带电荷的蛋白质或多肽片段在电离空间的运动速度和距离不同，因此其飞行的时间也各不相同。用质谱仪将各种蛋白质解析后在电离空间的运动速度和距离的轨迹记录和描绘下来，则会形成不同的曲线图形。这种测定、记录和描绘带电荷的蛋白质或多肽片段在电离空间的飞行时间的仪器就叫飞行时间质谱仪。2）MALDI-TOFMS概念3）MALDI-TOFMS的组成飞行时间质量检测器（TOF）。基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）数据库MALDI-TOFMS主机4)MALDI-TOFMS的原理基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，从而测得并绘出样品分子的质谱图。细菌主要是由蛋白质组成的。不同的细菌其蛋白质的种类和含量不同。不同的蛋白质解析后形成的多肽片段的种类、数量和分子量也不一样，因而在一定的条件下，在电离空间的运动速度和距离不同。用质谱仪将各种蛋白质解析后在电离空间的运动速度和距离的轨迹记录和描绘下来，则会形成不同的曲线图形。不同的蛋白质解析后在电离空间的运动速度和距离的轨迹图形均不相同，就像人类的指纹一样各自具有独特的特性。因此，这种运行轨迹的图形就被称为“蛋白质指纹”。蛋白质指纹图谱的分析每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。“激光解析电离飞行时间质谱仪”的基本原理就是用激光解析电离的方法使蛋白质解析并产生运动，从而描绘出待测微生物的蛋白质指纹谱图，通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理并和数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。与现有传统的微生物鉴定技术相比，具有操作简单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好、试剂耗品非常经济等优势。主要用途：1、生物反恐和生物战的防范：用于快速鉴别和证明现场反恐的生物物质。包括：炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、沙门氏菌、鼻疽、类鼻疽杆菌、肉毒杆菌、霍乱弧菌菌等。生物质谱仪可以在现场检测和分析生物毒剂，为应急预案快速启动提供宝贵的时间。2、临床细菌鉴定。3、院内感染监控。2、临床医学对临床微生物学检验的依赖性越来越强

（1）、细菌感染性疾病诊断的决定性依据取决于微生物学检验如：结核病的诊断呼吸道感染的诊断：引起呼吸道感染的细菌有：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、β-溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、葡萄球菌、肠杆菌科细菌、各类真菌等。究竟是哪一种细菌引起的呼吸道感染，这些感染菌应用那些抗菌药物去治疗？不经过细菌培养是不可能确定的。

消化道感染疾病：如伤寒、副伤寒、痢疾、其他消化道的病原菌感染等。小儿不明原因高热：

厌氧菌感染：临床厌氧菌感染范围广、感染率高，近年资料表明，肌坏死，腹膜炎等厌氧菌感染率分别高达100%，94%，如果不开展厌氧菌培养，就漏掉了感染的病原菌、延误治疗。（2）、抗菌药物的应用必须接受药敏试验的指导和监测使治疗方案有的放矢防止耐药菌株的生成减少延误病人治疗的几率减少病人的痛苦和经济负担

（二）、临床微生物学的应用相对落后

1、仪器水平落后，手工操作占主导地位这就导致了临床微生物检验的可变因素显得更加明显和突出。微生物实验的可变因素：（1）、采样的时限性：（2）、样品的多样性：（3）、病原菌的不可预测性：（4）、操作的原始性：（5）、判断的经验性：（6）、病原体的变异性：（7）、培养方法和培养基的针对性；2、培养时间过长，延误了临床诊断和治疗导致了：（1）、病人怨气

（2）、医生泄气（三）、造成发展和应用脱节的主要原因

1、成本价格与收费标准不协调成本：受市场调节——不断升高；收费：受物价控制——不断下降。2、经济发展条件的制约3、与临床沟通和宣传不到位，没有得到临床的足够重视和支持（四）、解决矛盾的主要途径和方法

1、努力反映和调整成本与收费的协调关系2、做出工作成效，发挥监测和监督作用3、加大宣传力度，多与临床沟通三、加强实验室与临床的沟通是促进临床微生物学发展的重要途径

（一）、医学检验实验人员加强临床知识的学习，接触病人、与临床工作者开展经常性的对话极为必要例一：临床分离出脑膜炎奈瑟氏菌引发争议。例二：血液中分离出草绿色链球菌（检验结果报告：标本污染）引发争议。例三：阴道分泌物检出革兰氏阴性球菌引发争议。

临床感染性疾病涉及的问题很多：就实验方法而言：没有任何单一的实验能够检出所有潜在的病原体。就病原体而言：没有任何病原体是完全致病或完全不致病的。因此，临床信息非常重要，它是作为选择实验方法的重要参考依据。临床医生在开化验单时应告诉实验人员有关病人的临床症状和推断性诊断，以便使实验人员能据此选择合适的培养基和合理的检验程序及方法，并能指导临床正确采集恰当的标本。

当实验室开始有实验结果时，必须通知临床医生，以便让他们能重新评价临床诊断和治疗方案。另外，实验室人员对危重抢救的病人和疑难症病人，需要看望病人，参加病例讨论，接受临床医生对诊断和诊治方面的咨询；要参加感染性疾病的会诊，提出有效治疗方案，尤其对检出细菌的种类和耐药情况做出说明，提出防止耐药性和医院感染的警报和措施。

施瓦茨（Schwarz）在《开展临床与实验室对话》一文中强调了实验室管理的要素是交流、对话。和临床医师定期交流，交换意见，可将医生的建议和专业问题深入阐述，这对只接触实验室标本的检验人员尤为重要。因为除了合格的标本、准确的操作外，临床用药等治疗措施、病人的临床症状与表现等也会影响检验结果。Schwarz提出：“