临床免疫检验课件-免疫原和抗血清的制备

2023/2/171第三章

免疫原和抗血清的制备2023/2/172第一节免疫原的制备

免疫原——是能诱导机体免疫系统产生特异性抗体和致敏淋巴细胞的抗原。

一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化三、人工抗原的制备

2023/2/173一、颗粒性免疫原的制备天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或寄生虫的细胞以及细菌抗原等，制备方法相对较简单。

绵羊红细胞的制备细菌免疫原的制备2023/2/1741.绵羊红细胞的制备绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原，制备方法是采集健康绵羊的静脉血，立即注入无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15～20min，以除去纤维蛋白，即得抗凝绵羊全血。免疫动物前，取适量抗凝血于离心管中，以无菌生理盐水洗涤细胞3次（每次2000rpm离心10min），然后取压积红细胞，稀释成106/ml浓度的细胞悬液，即可应用。2023/2/1752.细菌免疫原的制备选用经鉴定合格的标准菌株，接种于固体或液体培养基，置温箱37℃培养24h增菌后处理。菌体抗原需要100℃水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原后应用；而鞭毛抗原要用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理；细菌毒素抗原则应在杀菌后再加入0.5％～1％氯化钙溶液方可使用。有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。2023/2/176二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提（二）可溶性抗原的提取和纯化（三）免疫球蛋白片断的制备2023/2/177

（一）组织和细胞抗原的粗提（1）组织匀浆的制备（2）细胞的破碎

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反复冻融法

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冷热交替法

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超声破碎法

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自溶法

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溶菌酶处理法

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表面活性剂处理法2023/2/178（二）可溶性抗原的提取纯化1．超速离心法2．选择性沉淀法3.层析法4．电泳法2023/2/1791.超速离心和梯度密度离心法超速离心法

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差速离心：低速与高速交替进行

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密度梯度离心：属区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性目前，仅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白等，以及一些比重较轻的抗原物质如载脂蛋白A、B等的分离纯化2023/2/17102.选择性沉淀法（1）核酸沉淀剂法（2）盐析沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）聚合物沉淀法2023/2/17114.层析法（1）凝胶层析法：有名分子筛层析，是利用微孔凝胶将不同分子量的成分分离（2）离子交换层析：是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原，将蛋白质抗原按带电荷不同或量的差异分成不同的组分（3）亲和层析法：利用生物分子之间专一亲合力的特异性和可逆性分离技术。2023/2/1712（三）免疫球蛋白片断的制备1.分离非共价键2.分离共价键3.溴化氰裂解法4.酶裂解法2023/2/17131．分离非共价鍵肽链亚单位之间常为非共价键的结合，如氢键、疏水鍵及静电引力等。这些键结合力较弱，可经酸、碱、胍或脲等将其断开制备片段。2023/2/17142．分离共价鍵二硫键是连接免疫球蛋白的共价键，解离肽链间的二硫键可将轻链与重链分开。2023/2/17153．溴化氰裂解法溴化氰通过与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯。后者与水反应，将肽链断裂。2023/2/17164．酶裂解法酶解法专一性较好，不良反应少。不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶可将IgG

裂解成为两个Fab

和一个Fc

片段，胃蛋白酶可将IgG

裂解成为一个F(ab’)2片段和几个小肽段，胰蛋白酶则将IgG裂解成不规则的肽链。2023/2/1717

(四)纯化抗原的鉴定

常用的方法纯度测定用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法蛋白质含量用双缩脲法、紫外光吸收法分子量测定免疫电泳法免疫活性用免疫双扩散法……2023/2/1718三、人工抗原的制备人工抗原是指经过人工修饰的半抗原性免疫原，例如多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸以及化学物质等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原与蛋白质等大分子物质结合后，才能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。2023/2/1719三、人工抗原的制备人工结合抗原的制备人工合成抗原的制备基因工程抗原的制备2023/2/1720（一）人工结合抗原的制备2023/2/17211.

载体的选择蛋白质类：白蛋白多肽聚合物：多聚赖氨酸大分子聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮2023/2/17222.半抗原与载体的连接带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接。带有羟基、醛基、酮基的半抗原，如糖、多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等，不能直接与载体连接，需要用化学方法改造成羧基后才能与载体连接。芳香族半抗原由于环上带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代。2023/2/17233.半抗原性免疫原的鉴定半抗原与载体结合的数目与免疫原性相关。一般认为至少要20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效地产生抗体。当半抗原与载体连接完成后，应测定载体上所结合的半抗原量，常用吸收光谱分析法测定。2023/2/1724（二）人工合成抗原的制备用化学方法可将活化氨基酸聚合，使之成为多肽。同聚多肽、共聚多肽可根据蛋白质抗原的免疫原性片段进行氨基酸序列分析，或由其编码DNA推到出的氨基酸序列，构建人工合成多肽抗原。2023/2/1725（三）基因工程抗原的制备利用分子生物学技术，将编码抗原氨基酸序列的基因克隆，并与适当载体DNA连接，导入受体细胞，使之表达。可获得具有免疫原性的重组蛋白，经纯化后可作为抗原（重组抗原），也称为基因工程抗原。2023/2/1726第二节免疫佐剂免疫佐剂（immuno-adjuvant）是指同抗原一起或预先注射于机体，能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。简称佐剂。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。2023/2/1727佐剂的种类具有免疫原性的佐剂：细胞因子、百日咳杆菌、卡介苗、细胞酰二肽等。无免疫原性的佐剂：氢氧化铝、液体石蜡、羊毛脂、明矾、表面活性剂、脂质体、多聚肌苷酸：胞苷酸等。2023/2/1728常用佐剂

目前应用最多的是福氏佐剂(Freund’sadjuvant)。它是由液体石蜡、羊毛脂和卡介苗混合而成。福氏佐剂又可分为两种：①不完全福氏佐剂:是由液体石蜡与羊毛脂按1～5：1比例混合而成；②福氏完全佐剂:在不完全佐剂中加卡介苗(终浓度为2～20mg/ml)，即成为完全福氏佐剂。在免疫动物时，应先将福氏佐剂与抗原按1:1体积比混匀，制成“油包水”乳化液。2023/2/1729福氏（Freund）佐剂佐剂Freund不完全佐剂=石蜡油+羊毛脂Freund完全佐剂=石蜡油+羊毛脂+卡介苗2023/2/1730二、佐剂的作用机理

佐剂的作用可能机理：①可以增加抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；②佐剂与抗原混合可改变抗原的物理性状，延长抗原在局部组织的贮存时间，使抗原缓慢释放；③刺激单核-巨噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力，④刺激淋巴细胞增殖和分化，提高机体初次应答和再次应答的课题滴度。⑤改变抗体产生的类型及诱导迟发型变态反应。2023/2/1731第三节抗血清的制备一、动物的选择：种群关系、动物的个体状况、抗原性质、免疫血清用量合要求二、免疫方法：剂量、时间和途径三、动物采血法

1.颈动脉放血法

2.心脏采血法

3.静脉多次采血法

2023/2/1732第四节免疫血清的纯化由抗原免疫动物制备的免疫血清是成分复杂的混合物，除了含有特异性抗体外，还存在非特异性抗体和其他的血清成分。因此，在应用抗血清前必须先行纯化，以去除杂抗体防止血清中的其他成分干扰试验结果。2023/2/1733一、特异性抗体的纯化

1．亲和层析法：Sepharose4B柱

2．吸附法：杂抗原吸附杂抗体

2023/2/17341．亲和层析法将相应的杂抗原交联到Sepharose4B上，装柱后，将欲纯化的免疫血清通过亲和层析柱，使杂抗体吸附于柱上，洗脱液则为特异性抗体。抗血清2023/2/17352．吸附法将双功能试剂（如戊二醛）加入不含特异性抗原的杂抗原混合液（如血清、组织液或已知的某种杂抗原），制备成颗粒状固相吸附剂。将此吸附剂直接加到免疫血清中（约1∶10），使杂抗体和相应抗原结合而去除。当杂抗体较多时，必须处理两次才能达到目的。2023/2/1736二、IgG类抗体的纯化

1．盐析法粗提γ球蛋白

2．离子交换层析提取IgG

：DEAE3．亲和层析法2023/2/1737第五节抗血清的鉴定与保存抗血清的鉴定抗体效价的测定抗体特异性鉴定抗体纯度鉴定抗体亲和力鉴定抗血清的保存2023/2/1738一、抗血清的鉴定2023/2/1739（一）抗体效价的测定

根据抗原性质不同，可采取不同抗体效价测定方法。颗粒性抗原可采用凝集试验。可溶性抗原常用免疫双扩散法。2023/2/1740抗原抗血清不稀释½

¼1/81/161/321/641/128不稀释½¼1/81/161/321/64++++++++++++++－－++++++++++++++－－++++++++++++++

－－+++++++++++－－+++++++++－－++++－－－－++++－－－－表10-1抗血清效价测定2023/2/1741（二）抗体特异性鉴定抗体的特异性鉴定一般用特异性抗原及其相似的抗原与待鉴定抗体进行免疫双扩散试验。如果出现交叉反应，说明有杂抗体存在。可应用相应抗原吸收杂抗体，即可得到单价特异性抗体。2023/2/1742（三）抗体纯度鉴定抗体的纯度鉴定可采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法。若只出现一条蛋白电泳区带说明抗体纯化已达到要求，而出现多条蛋白区带则表明抗血清中混有杂蛋白，必须进一步纯化。2023/2/1743（四）抗体亲和力鉴定抗体的亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力关系到实验方法的敏感性，是评价抗体质量的重要指标。抗体亲和力大