第二节食品蛋白质及氨基酸

第二节食品蛋白质及氨基酸第一页，共二十八页，2022年，8月28日一、概述

（一）食物蛋白质的主要作用

（1）供给人体蛋白质生物合成所需要的各种氨基酸，是人体组织生长、修补和更新的原料。

（2）在体内氧化产生能量，是人体的热能来源之一。

（3）参与酶、激素和血红蛋白等的组成，调节人体有关生理功能的正常进行。

（4）参与免疫系统和对某些有毒物质的解毒作用。

（5）蛋白质在遗传信息的控制，细胞膜的通透性以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起着重要的作用。第二页，共二十八页，2022年，8月28日（二）蛋白质的理化性质

蛋白质（protein）是复杂的含氮化合物，分子量很大，大部分高达数万～数百万，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素。但含氮则是蛋白质区别于其它有机物的主要标志。

蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的中间产物为胨、肽等，最终产物为氨基酸。

第三页，共二十八页，2022年，8月28日（三）氨基酸的作用

氨基酸（aminoacids）是合成蛋白质的基本结构单位，组成蛋白质的氨基酸有20多种，其中有些氨基酸在人体内不能合成或合成量不足，必需由食物供应，是蛋白质生物合成所必需的，又称为必需氨基酸，这些氨基酸有色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸8种，对于婴儿还有组氨酸。另一部分氨基酸在体内蛋白质生物合成时也是需要的，但能在体内合成，不一定由食物供给，称非必需氨基酸。

第四页，共二十八页，2022年，8月28日二、蛋白质的测定

（一）凯氏定氮法

测定蛋白质含量的方法很多，国家标准方法为凯氏（Kjeldahl）定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一。

凯氏定氮法测定蛋白质的主要依据是：各种蛋白质均有恒定的含氮量，只要能准确测定出食物中的含氮量，即可推算出蛋白质的含量。

注意：凯氏定氮法所测得的含氮量为食品中的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等。故由定氮法计算所得蛋白质的量，称为粗蛋白质（crudeprotein）含量。第五页，共二十八页，2022年，8月28日乳制品6.38花生5.46肉6.25面粉5.70米5.95大麦、小米5.83玉米、高梁6.24大豆5.71芝麻、向日葵5.30氮换算为蛋白质的系数第六页，共二十八页，2022年，8月28日（1）基本原理

蛋白质样品与硫酸和催化剂（硫酸钾和硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成CO2和H2O逸出，样品中的有机氮被分解为氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

最低检出量为0.05mg氨，相当于0.3mg蛋白质。

第七页，共二十八页，2022年，8月28日第八页，共二十八页，2022年，8月28日

（2）操作注意事项

①样品的消化：

2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4→（NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氧；

浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳、氢氧化为CO2

和H2O，硫酸被还原为SO2，SO2使氮还原为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵。

加硫酸钾－－提高溶液沸点，加快有机物分解。

溶液沸点可从340℃提高至400℃以上。

加硫酸铜－－催化剂，缩短消化时间。此外还可指示消化终点的到达（Cu2SO4褐色CuSO4蓝绿色）。第九页，共二十八页，2022年，8月28日

②蒸馏：

（NH4）2SO4＋2NaOH2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O

蒸馏时样品中的氨是否蒸完，可用精密pH试纸测试冷凝液是否显碱性来确定。也可用标准硫酸铵作回收试验，确定蒸馏条件，并严格掌握蒸馏时间。

③吸收与滴定：

2NH3＋4H3BO3（NH4）2B4O7＋5H2O

（NH4）2B4O7＋2HCl＋5H2O2NH4Cl＋4H3BO3

使用混合指示剂，目的是使变色敏锐。在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。第十页，共二十八页，2022年，8月28日GB\GB5009.5-2010食品中蛋白质的测定.pdf第十一页，共二十八页，2022年，8月28日（3）测定样品的蛋白氮

向样品中加入三氯乙酸溶液使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液样品上清液中的含氮量，进一步算出蛋白质含量：

蛋白氮=总氮－非蛋白氮第十二页，共二十八页，2022年，8月28日（二）水杨酸比色法

样品中的蛋白质经硫酸消化转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水杨酸钠溶液与次氯酸钠溶液作用生成有颜色的化合物，可在660nm处比色测定，由所求的含氮量，换算成蛋白质含量。

（三）福林－酚比色法

是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。

蛋白质与福林（Folin）－酚试剂反应后，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也与蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸——磷钨试剂反应产生颜色，呈色强度与蛋白质含量成正比。第十三页，共二十八页，2022年，8月28日双缩脲反应：脲素加热至150-160℃左右，两分子脲素脱去一分子氨，生成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。第十四页，共二十八页，2022年，8月28日三、氨基酸的组成分析

1、纸上层析分离测定：

2、薄层层析分离测定：

3、纸上电泳分离测定：带电粒子（胶粒或分子）在直流电场作用下，能向异性电极移动，这种现象称为电泳。

第十五页，共二十八页，2022年，8月28日

4、气相色谱法分离测定：

（1）原理：

将氨基酸通过正丁醇的酯化和三氟醋酸酐（TFAA）的酰化后，转变成适合于气相色谱分析的氨基酸衍生物——三氟乙酰基二丁酯，反应产物用气相色谱进行测定。

（2）气相色谱仪：带程序升温和氢火焰离子检测器。

程序升温：进样后3.5min，以4℃/min程序升温，从80℃～215℃。第十六页，共二十八页，2022年，8月28日

（3）样品处理：

第一步酯化反应：将经蛋白质水解得到的稀盐酸（0.1mol/L）氨基酸溶液加入10ml容量瓶中，置于100℃砂浴中，吹入高纯氮气，蒸发水分。待恰好干燥时取出，加入0.5ml二氯甲烷溶液，再置于砂浴中，继续吹入高纯氮气，使残余的水分和二氯甲烷成共沸物吹出。吹干后，加入盐酸浓度为3mol/L的盐酸—正丁醇溶液，在超声波浴中振荡2min，以加速氨基酸的溶解（当样品中有碱性氨基酸和胱氨酸等组分时，尤需此步骤，否则氨基酸不能溶解影响酯化反应的进行）。盖紧磨口塞，将容量瓶置于100℃砂浴中，酯化35min。

R—CH-NH2—C=O-OH＋C4H9OH

R—CH-NH3+Cl—C=O-OC4H9＋H2O第十七页，共二十八页，2022年，8月28日

第二步酰化反应：酯化后稍冷，吹入高纯氮气，在砂浴中蒸发正丁醇和盐酸，再加入二氯甲烷进行共沸，进一步除去水分。最后加入0.2ml三氟乙酸酐溶液和0.6ml二氯甲烷，在超声波浴中震荡1～2min，将磨口塞继续塞紧后，置于干燥器中于室温下进行酰化反应。2h后可对形成的衍生物进行气相色谱分析。

R—CH-NH3+Cl—C=O-OC4H9＋（CF3C=O）2O

R—CH-NH-C=O-CF3—C=O—OC4H9

第十八页，共二十八页，2022年，8月28日

5、液相色谱分离测定：

（1）原理：

蛋白质样品经酸或碱水解后，再用丹磺酰氯进行衍生化作用，用反相液相色谱、C8反相柱，采用荧光检测器能良好地测定出各种氨基酸的含量。（24种）

（2）液相色谱仪：荧光检测器，激发波长298nm，发射波长546nm。具有10μm粒度C8反相柱和梯度洗脱程序系统。

第十九页，共二十八页，2022年，8月28日

（3）样品处理：

①蛋白质的水解：蛋白质样品中加入6mol/LHCl溶液，封口，移入110℃恒温箱中加热16-24h，加亮氨酸作为内标溶液，在水浴中蒸发干燥。

②衍生物制备及其测定：调pH为10.5，再加入丹磺酰氯工作试剂，封口，充分振摇15min，再于100℃水浴中加热2min。加入混合流动相溶液后进样，记录色谱图。

③各种氨基酸标准溶液同样品处理。

第二十页，共二十八页，2022年，8月28日

6、氨基酸自动分析仪法分离测定：国标法。

不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测定。

（1）原理

食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，利用各种氨基酸的离子特性、极性和分子量大小等性质的不同，使用阳离子交换树脂进行色谱分离，再用不同的pH值和离子浓度的缓冲液依次将它们洗脱，被洗脱下来的氨基酸与茚三酮溶液产生颜色反应，进行定量比色分析。第二十一页，共二十八页，2022年，8月28日

洗脱的顺序为：酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的和芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸。相对分子质量小的比相对分子质量大的先下来。

（2）蛋白质水解

准确称取一定量的试样放入水解管中，在水解管中加入6mol/L盐酸10-15mL，再将水解管放入冷冻剂中冷冻3-5min，抽真空，充氮气，重复三次，在充氮气状态下封口。将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。第二十二页，共二十八页，2022年，8月28日（3）样品处理

样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质时，必须先除去杂质后再进行酸水解处理。

糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质的去除法：

①去糖和淀粉：样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。

②去脂肪：先将干燥的样品研碎后，用丙酮或乙醚等有机试剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。

③去核酸：将样品置于10%氯化钠溶液中，于85℃加热6小时，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥。

④去无机盐：样品经水解后含有大量的无机盐时，必须用阳离子交换树脂处理—去盐处理。第二十三页，共二十八页，2022年，8月28日

（4）样品分析

把经处理后的样品上柱分析，上柱的样品量视自动分析仪的灵敏度而定。上机测定用的混合氨基酸标准液浓度为5.00nmol/50µL