生物芯片与高通量测序技术

生物芯片与高通量测序技术HonglinZhu2021-06-04基因组学技术开展时间表生物芯片是传统点杂交技术的高通量革命！是把大量序列探针集成在同一个基片上,经过处理和标记的假设干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交,通过检测杂交信号,对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析高通量测序是传统sanger技术的高通量革命！一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。概述：芯片与高通量测序1.28cm1.28cm

Upto~1Mfeatures/chip5µm5µm

******Millionsofidentical

probes/feature芯片与高通量测序是两种重要的高通量基因组学研究技术,对于揭示基因组的结构与功能已经并正在发挥重要的作用.基因组学高通量技术检测Detection发现DiscoverMicroarraySEQ概述：芯片与高通量测序研究层次芯片平台测序平台用途基因组SNP芯片全基因组重测序、全基因组从头测序、基因组捕获测序用于研究各种生物DNA序列的差异和单核苷酸多态性，同时研究这些差异对疾病、诊断、预后的影响。CGH芯片用于研究基因拷贝数的变化，从而明确疾病相关遗传基因，阐明其致病机制转录组表达谱芯片DGE、RNA-Seq(针对不同种类RNA的大小及结构特点，可采用不同的方法进行分离和富集)用于大规模分析一定生物对象在特定条件下基因表达变化的全面信息Exon芯片RNA-Seq表达谱芯片只能检测正常表达的mRNA；外显子芯片除了检测表达的mRNA外，还能检测可变剪接miRNA芯片miRNA-Seq

(分离出miRNA)用于研究miRNA的功能及其在动植物生长发育、细胞分化和凋亡以及人类疾病的发生等过程中的作用蛋白组蛋白芯片-用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达丰度，目前主要用于信号转导、蛋白质组学、肿瘤及其它疾病相关研究。表观遗传学ChIp-on-chip芯片ChIp-Seq用于研究蛋白质与DNA的相互作用。从而阐明真核生物基因表达机制。DNA甲基化芯片BisulfiteSequencingMBD-Sequencing在全基因组水平研究DNA甲基化在发育、染色体失活以及人类疾病中的变化芯片和高通量测序目前已有的商业平台Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness,resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms.PeterA.C.’tHoen1,*,YavuzAriyurek1,HeleneH.Thygesen1,ErnoVreugdenhil2,RolfH.A.M.Vossen1,etcNucleicAcidsResearch,2021,Vol.36,No.21芯片与二代测序技术平台比较-----数字表达谱与五种芯片平台五种芯片平台，产生的数据与NGS数据相关性很低？本文中测试的NGS与RealtimePCR相关性：R=0.35MAQC系列实验中，芯片数据与Realtime相关性不小于0.8TheMicroArrayQualityControl(MAQC)projectshowsinter-andintraplatformreproducibilityofgeneexpressionmeasurements.2006,NatureBiotechnology-----数字表达谱与五种芯片平台芯片与二代测序技术平台比较NATUREMETHODS|VOL.6NO.5|MAY2021mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecellFuchouTang1,3,CatalinBarbacioru2,3,YangzhouWang2,EllenNordman2,ClarenceLee2,NanlanXu2,XiaohuiWang2,JohnBodeau2,BrianBTuch2,AsimSiddiqui2,----利用单细胞表达谱测序芯片与二代测序技术平台比较二轮放大之后的样品分别采用：芯片、测序和Taqman探针法进行检测。“二代测序技术〞发现了不同样品中外显子的不同表达丰度结果显示：技术之间已开始具有良好相关性测序对于检测极低丰度转录本具有优势----利用单细胞表达谱测序芯片与二代测序技术平台比较以生物学材料作为实验对象，对样品本身的真实情况缺乏客观评估。该项研究利用人工合成的microRNApool比较芯片与高通量测序检测microRNA的定量效果和发现新信息的能力。QuantitativemiRNAexpressionanalysis:Comparingmicroarrayswithnext-generationsequencingHANNIWILLENBROCK,JESPERSALOMON,ROLFSØKILDE,KIMBUNDVIGBARKEN,THOMASNØHRHANSEN,FINNCILIUSNIELSEN,4SØRENMØLLER,1andTHOMASLITMARNA(2021),15:2028–2034.----利用人工合成的microRNAPool芯片与二代测序技术平台比较但两种技术显示出较高的相关性R=0.93相比较芯片方法，测序在定量上稍逊一筹人工样品库的制备：16个合成的microRNAPool形成从0.0625到16倍的浓度梯度，log2范围从-4到4.检测两种方法的定量能力。----利用人工合成的microRNAPool芯片与二代测序技术平台比较Mapping/AlignmentDenovoassemblyBiologicalverificationandinterpretationBiologicalquestionExperimentaldesignMicroarrayexperimentSequencingRawintensityRawreadsQC+preprocessFusedgenesAlternativespliceidentifyDEanalysisGO&PathwayClusterAnalyzecSNPcallingSSRdepthanalysis…芯片与二代测序技术分析流程比较〔以ExpressionArrayvsRNA-Seq为例〕NormalizationRMAPLIERQuantileLOWESSRPMRPKM等测序的开展对计算和数据分析提出了挑战高通量测序技术产生的速度超过目前计算科学的开展速度高性能计算+高速网络+高效能存储芯片是一个封闭的检测系统，只能检测的信息；测序是一个开放的发现系统，可以发现新的信息；芯片平台经过了近20年的开展，具有完整成熟的质控标准和分析手段；测序系统的数据质控标准和分析方法有待更完善和标准化芯片平台比较稳定，在检测上与Realtime吻合性较高，测序平台准确性正逐步提高，并且对于检测极低丰度转录本或低频SNP位点具有优势芯片数据分析PC机可以完成，测序分析需要“高性能计算+高速网络+高效能存储〞整套解决方案芯片与二代测序技术平台比较※※※※比较结论：芯片在TargetedSequencing中发挥作用二代测序获得许多未知序列物种信息，利用芯片可以进行大量样本研究芯片与二代测序联合应用TargetedSequencing采用Targetenrichment〔Agilent〕+NGS(solexa)的技术，对一个疾病，Freeman-Sheldonsyndrome进行捕获测序。通过采用多步骤分类检测法，滤掉普通变异和个人独具的变异后，研究人员从4名Freeman-Sheldon综合征患者的DNA中准确找出了致病基因(MYH3)变异。他们的研究说明，对于单个基因变异引起的疾病，外显子测序同样可以准确找到致病基因。外显子测序也可用于多重基因变异引起的常见疾病，如糖尿病和癌症的研究中，来揭示该种疾病的致病基因。应用案例一：应用案例二：AlexanderHoischen等用AgilentSureselecthumanexomekits结合SOLiD测序技术分别对无血缘关系的4名Schinzel-Giedion综合症患者的外显子组序列进行了测序，发现这4个样本在SETBP1位点均存在杂合新生突变〔heterozyousdenovomutation〕，用Sanger法对另外8个患儿的SETBP1位点进行测序验证，亦发现该位点同时出现了突变，而所有的点突变集中在高度保守的11nt的外显子区域。随后的研究说明，这些突变引发了Schinzel-Giedion综合症。NatureGenetics VOLUME42|NUMBER6|JUNE2021NicholasAK,KhurshidM,DésirJ,CarvalhoOP,CoxJJ,ThorntonG,KausarR,AnsarM,AhmadW,VerloesA,PassemardS,MissonJP,LindsayS,GergelyF,DobynsWB,RobertsE,AbramowiczM,WoodsCG.WDR62isassociatedwiththespindlepoleandismutatedinhumanmicrocephaly.NatGenet,2021,42(11):1010–1014.SunY,AlmomaniR,AtenE,CelliJ,vanderHeijdenJ,VenselaarH,RobertsonSP,BaronciniA,FrancoB,Basel-VanagaiteL,HoriiE,DrutR,AriyurekY,denDunnenJT,BreuningMH.TerminalosseousdysplasiaiscausedbyasinglerecurrentmutationintheFLNAgene.AmJHumGenet,2021,87(1):146–153.NikopoulosK,GilissenC,HoischenA,vanNouhuysCE,BoonstraFN,BloklandEA,ArtsP,WieskampN,StromTM,AyusoC,TilanusMA,BouwhuisS,MukhopadhyayA,SchefferH,HoefslootLH,VeltmanJA,CremersFP,CollinRW.Next-generationsequencingofa40MblinkageintervalrevealsTSPAN12mutationsinpatientswithfamilialexudativevitreoretinopathy.AmJHumGenet,2021,86(2):240–247.RehmanAU,MorellRJ,BelyantsevaIA,KhanSY,BogerET,ShahzadM,AhmedZM,RiazuddinS,KhanSN,RiazuddinS,FriedmanTB.Targetedcaptureandnext-generationsequencingidentifiesC9orf75,encodingtaperin,asthemutatedgeneinnonsyndromicdeafnessDFNB79.AmJHumGenet,2021,86(3):378–388.Rosa-RosaJM,Gracia-AznárezFJ,HodgesE,PitaG,RooksM,XuanZY,BhattacharjeeA,BrizuelaL,SilvaJM,HannonGJ,BenitezJ.Deepsequencingoftargetlinkageassay-identifiedregionsinfamilialbreastcancer:methods,analysispipelineandtroubleshooting.PLoSOne,2021,5(4):e9976.ChouLS,LiuCSJ,BoeseB,ZhangXM,MaoR.DNAsequencecaptureandenrichmentbymicroarrayfollowedbynext-generationsequencingfortargetedresequencing:neurofibromatosistype1geneasamodel.ClinChem,2021,56(1):62–72.2021年1月10日，Illumina公司宣布推出HiSeq2500，这款新一代测序系统让研究人员和临床医生能够在大约24小时内完成整个基因组的测序，即“一天一个基因组〞。HiSeq2500充分利用了HiSeq2000和MISeq平台上不断的技术进步。公司预计在2021年下半年全面出售HiSeq2500，标价74万美元，也可从HiSeq2000升级，升级价格5万美元。英国牛津纳米孔公司亮相的比手掌还小的测序仪2021年2月25日，英国牛津纳米孔技术公司在佛罗里达州基因组生物学与技术会议上宣布了一个爆炸性消息，即推出GridION和MinION两款基于新一代DNA测序技术的便携式基因组测序仪，后者仅有U盘大小，可插入电脑USB端口完成测序，价格仅900美元。两个仪器都是基于纳米孔测序技术，采用一种特殊的蛋白在薄膜结构上打出纳米级小洞或小孔，在膜的一侧施加电压将单条DNA链〔带负电〕拉进纳米孔。当DNA的化学碱基通过时，引起细微的电流变化，测量这种变化即可识别出不同的碱基〔T、C、G和A〕组成顺序，然后通过电脑将每一局部的结果编织在一起呈现。2021年测序仪市场动态在基因测序仪器装备上，美国宣称要在2021年底推出第三代基因测序仪，英国、日本和其它欧洲国家也有相关的研发方案。中国，在2021年12月，中科院与浪潮集团宣布联手共同研制国产第三代基因测序仪，并方案在3年内问世。如假设成功，将有望缓解目前国内研究所使用的基因测序仪完全依赖进口、价格昂贵的窘境，并填补我国在基因测序根底装备领域的空白。第三代测序的开展第三代测序基因测序仪开展中科院与浪潮集团宣布联手共同研制国产第三代基因测序仪第三代测序技术原理〔基于纳米孔单分子读取〕

在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠被称为核酸外切酶的蛋白质以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化。纳米孔严格限制了DNA单链可以通过的空间,每次只允许一个核苷酸按照原有的次序通过.DNA分子通过纳米孔时,它们的序列会被逐一分辨出。

纳米孔技术不需要荧光标记物并且很可能不需要进行扩增，能直接并快速“读〞出DNA，