第十二章细胞增殖及其调控

细胞增殖(cellproliferation)的意义◆细胞增殖(cellproliferation)是细胞生命活动的重要特征之一,是生物繁育的基础。◆单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。第一页，共八十二页。◆多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。◆成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。◆机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要

依赖细胞增殖。第二页，共八十二页。第一节

细胞周期概述

●细胞周期●细胞周期的过程●细胞周期同步化一、细胞周期(cellcycle)概述

第三页，共八十二页。细胞周期◆概念：从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累，直到下一次分裂结束所经历的过程，分为分裂间期和分裂期。◆细胞周期时相组成◆细胞周期时间◆根据增殖状况，细胞分类三类第四页，共八十二页。细胞周期时相组成◆间期(interphase):G1期(从有丝分裂完成到DNA复制之前的时期)，S期(DNA复制的时期),G2期(从DNA复制完成到有丝分裂开始这段时期)◆M期:有丝分裂期(Mitosis)。细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，在M期细胞先是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。第五页，共八十二页。间期分裂期第六页，共八十二页。细胞周期时间不同细胞的细胞周期时间差异很大·S+G2+M的时间变化较小，细胞周期时间长短主要差别在G1期·有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期(如动物胚胎细胞分裂)第七页，共八十二页。第八页，共八十二页。一些真核细胞的细胞周期细胞类型细胞周期早期蛙卵胚胎细胞酵母细胞肠上皮细胞培养的哺乳类成纤维细胞人肝细胞第九页，共八十二页。根据增殖状况，细胞分类三类◆周期中细胞(cyclingcell)保持持续分裂能力,再进入细胞周期◆终末分化细胞永久失掉了分裂的能力◆静止期细胞(Go细胞)

暂时脱离细胞周期,不进行增殖,但给予适当刺激后,可以重新进入周期开始分裂。如某些免疫淋巴细胞,肝,肾细胞等。第十页，共八十二页。第十一页，共八十二页。（二）细胞周期的过程◆G1期◆S期◆G2期◆M期第十二页，共八十二页。G1期

从有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期,叫合成前期,此期主要合成细胞生长所需要的多种蛋白质、rRNA、碳水化合物、等，在G1的后期，DNA合成酶的活性大大增。同时染色质去凝集。第十三页，共八十二页。S期·DNA复制与组蛋白合成同步，使新合成的DNA能及时包装成核小体。·DNA在复制时，不同的序列复制先后不同，具有时间顺序：常染色体

先异染色体后能转录的DNA先不能转录的DNA后GC含量高先AT含量高后

第十四页，共八十二页。G2期

DNA复制完成，在G2期主要合成ATP、一定数量的蛋白质和RNA分子，包括微管蛋白和成熟促进因子MPF等，为有丝分裂做准备。第十五页，共八十二页。

即细胞分裂期，从染色体的凝缩、分离并平均分配到两个子细胞为止。真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。M期第十六页，共八十二页。细胞周期检验点(checkpoint)◆细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制,主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系

检验点严格监视着细胞周期事件的发生、发展是否严格按程序进行，决定细胞能否进入下一时期。如DNA损伤未修复前不能进入S期

第十七页，共八十二页。◆细胞周期检验点及其作用

G1期检验点（靠近G1末期）：酵母——Start；动物细胞——限制点RestrictionPoint：主要监测细胞的大小和环境状态，如果条件合适，就会激发DNA复制，使控制系统向前移动。是细胞周期的主要控制点，决定细胞能否分裂。第十八页，共八十二页。G2检验点（在G2期结束点）检测细胞的大小，细胞所处的状态，以及细胞内DNA是否复制完毕，如果这些条件合适，就会进入有丝分裂中－后期检验点：纺锤体装配检验点（在中期末）监测所有的染色体是否都与纺锤体相连，并排列在赤道板上；检测MPF是否失活，否则不能进行有丝分裂和胞质分裂第十九页，共八十二页。Checkpointandtheeventscheckedfor染色体是否与纺锤体相连第二十页，共八十二页。（三）细胞周期长短测定◆脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法◆流式细胞仪测定法(FlowCytometry)◆缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。第二十一页，共八十二页。细胞周期各阶段的时间TG2－G2期时间，TM－M期时间，TS－S期时间，TC－细胞周期时间，TG1＝TC－（TG2＋TM＋

TS）第二十二页，共八十二页。G2MG0G1s0200400600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

流式细胞仪测定法(FlowCytometry)第二十三页，共八十二页。细胞数量DNA含量流式细胞分选仪测定法第二十四页，共八十二页。（四）细胞周期同步化◆自然同步化，如有一种粘菌的变形体plasmodia，某些受精卵早期卵裂

◆人工选择同步化

◆药物诱导法第二十五页，共八十二页。果蝇受精卵中早期分裂是同步进行的且分裂速度很快,在一个共同的细胞质中,只有细胞核分裂而无相应的细胞分裂第二十六页，共八十二页。人工选择同步化·细胞分裂收获法：用于单层贴壁生长细胞。优点是细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点是分离的细胞数量少。·密度梯度离心法：根据不同时期的细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点是方法简单省时，效率高，缺点是对大多数种类的细胞并不适用。第二十七页，共八十二页。第二十八页，共八十二页。药物诱导法·

DNA合成阻断法：采用DNA合成抑制剂抑制DNA合成。高浓度的胸腺嘧啶能够阻断DNA合成所需的核苷酸的合成，即不能合成DNA，细胞不能进入S期，最终将细胞群阻断于G1/S交界处。一般采用两次DNA合成抑制剂处理。优点是同步化效率高，几乎适合于所有体外培养的细胞体系。缺点是诱导过程可造成细胞非均衡生长。第二十九页，共八十二页。TdR阻断法进行细胞同步化第三十页，共八十二页。分裂中期阻断法：通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点是操作简便，效率高。缺点是这些药物的毒性相对较大。常用药物是秋水仙素。第三十一页，共八十二页。◆条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。第三十二页，共八十二页。（五）特异的细胞周期特异的细胞周期是指那些特殊的细胞所具有的与标准的细胞周期相比有着鲜明特点的细胞周期。

◆爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期◆酵母细胞的细胞周期◆植物细胞的细胞周期◆细菌的细胞周期第三十三页，共八十二页。爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期·细胞分裂快,G1期、G2期非常短,S期也短(所有复制子都激活),

以至认为仅含有S期和M期，无需临时合成其它物质，子细胞在G1、G2期并不生长，越分裂体积越小·细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准的细胞周期基本是一致的第三十四页，共八十二页。爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期第三十五页，共八十二页。酵母细胞的细胞周期

酵母细胞的细胞周期与标准的细胞周期在时相和调控方面相似。·酵母细胞周期明显特点:酵母细胞周期持续时间较短；封闭式细胞分裂，即细胞分裂时核膜不解聚纺锤体位于细胞核内；在一定环境下，也进行有性繁殖第三十六页，共八十二页。芽殖酵母的细胞周期起始点过后，细胞出芽进入S期纺锤体装配与S期DNA复制同时进行。第三十七页，共八十二页。裂殖酵母的分裂周期第三十八页，共八十二页。均等分裂，细胞生长仅是细胞长度的增加起始点有明显形态学标志裂殖酵母芽殖酵母第三十九页，共八十二页。植物细胞的细胞周期植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准细胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四个时期。·植物细胞不含中心体，但在细胞分裂时可以正常组装纺锤体。·植物细胞以形成中间板的形式进行胞质分裂第四十页，共八十二页。植物细胞的细胞周期第四十一页，共八十二页。细菌的细胞周期慢生长细菌细胞周期过程与真核细胞周期过程有一定相似之处。其DNA复制之前的准备时间与G1期类似。分裂之前的准备时间与G2期类似。再加上S期和M期，细菌的细胞周期也基本具备四个时期。

第四十二页，共八十二页。快速生长时，细胞周期有较大的变化，细菌分裂一次仅需35min。而完成一次DNA复制需要40min,DNA复制前准备（G1）约10min；分裂前准备（G2）约20min；一个周期70min。·细菌在快速生长情况下，如何协调快速分裂和最基本的DNA复制速度之间的矛盾?

在上一次细胞分裂结束时，细胞内的DNA已经复制到一半。第四十三页，共八十二页。第四十四页，共八十二页。二、有丝分裂(mitosis)●前期(prophase)●前中期(prometaphase)●中期(metaphase)●后期(anaphase)

●末期(telophase)第四十五页，共八十二页。第四十六页，共八十二页。前期(prophase)◆标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体◆第二个特征细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始装配◆Golgi体、ER等细胞器解体，形成小的膜泡这种染色体由两条染色单体(chromatid)构成 ·在前期末，染色体主缢痕部位形成一种蛋白复 合物称为动粒(kinetochore)第四十七页，共八十二页。

间期动物细胞含一个MTOC，即中心体，在S期末，两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒，形成两个中心体。当前期开始时，2个中心体移向细胞两极，并同时组织微管生长，由两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相连，最后形成有丝分裂纺锤体。第四十八页，共八十二页。前中期(prometaphase)◆核膜破裂成小的膜泡，这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体◆纺锤体微管与染色体的动粒结合，捕捉住染色体，每个已复制的染色体有两个动粒，朝相反方向，保证与两极的微管结合；纺锤体微管捕捉住染色体后，形成三种类型的微管◆不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。第四十九页，共八十二页。中期(metaphase)◆所有染色体排列到赤道板(MetaphasePlate)上，标志着细胞分裂已进入中期◆是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上？

第五十页，共八十二页。后期(anaphase)

◆排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动。◆后期(anaphase)大致可以划分为连续的两个阶段，即后期A和后期B。·后期A，动粒微管去装配变短，染色体产生两极运动。·后期B，极间微管长度增加，两极之间的距离逐渐拉长，介导染色体向极运动。第五十一页，共八十二页。末期(telophase)◆染色单体到达两极，即进入了末期（telophase）,到达两极的染色单体开始去浓缩◆核膜开始重新组装◆Golgi体和ER重新形成并生长◆核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐恢复,有丝分裂结束。第五十二页，共八十二页。胞质分裂(Cytokinesis)

动物细胞胞质分裂◆胞质分裂(cytokinesis)开始于细胞分裂后期，在赤道板周围细胞表面下陷，形成环形缢缩，称为分裂沟(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体和钙离子浓度的变化有关 ◆胞质分裂开始时，大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束，环绕细胞，称为收缩环。收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞第五十三页，共八十二页。植物细胞胞质分裂

◆与动物细胞胞质分裂不同的是，植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和胞壁而将细胞分开第五十四页，共八十二页。植物细胞胞质分裂第五十五页，共八十二页。1、中心体（二）与有丝分裂直接相关的亚细胞结构2、动粒与着丝粒动粒又称着丝点，是附着于着丝粒上的一种细胞器，其外侧用于纺锤体微管附着，内侧与着丝粒相互交织。第五十六页，共八十二页。第五十七页，共八十二页。动粒动粒微管复制好的染色体着丝粒区染色单体第五十八页，共八十二页。3、纺锤体纺锤体是细胞分裂过程中的一种与染色体分离直接相关的细胞器，由微管和微管结合蛋白组成，两端为星体。功能是将遗传物质均等分配到两个子细胞。纺锤体微管类型动粒微管：一端固定在着丝粒上。另一端在中心体上或其附近，每个着丝点有从中心体长出15－30条微管与之结合极性微管：不与染色体相互作用，一端在中心体内，另一端游离。第五十九页，共八十二页。微管中心体极性微管纺锤极纺锤体的装配：移动素类蛋白KRPs,细胞质动力蛋白第六十页，共八十二页。第六十一页，共八十二页。第六十二页，共八十二页。星体微管动粒微管极微管纺锤极动粒复制好的染色体第六十三页，共八十二页。（三）有丝分裂过程染色体运动的动力机制1、染色体列队与染色体列队相关的蛋白：Mad蛋白和Bub蛋白，可使动粒敏化，促使微管与动粒接触。Mad2和Bud1位于前中期染色体的动粒上，如果染色体被纺锤体微管捕获，Mad2和Bud1蛋白很快从动粒上消失。反之，则不消失，后期不能启动。第六十四页，共八十二页。Mad蛋白和Bub蛋白使动粒敏感化，使动粒与微管接触染色体列队第六十五页，共八十二页。染色体列队假说牵拉假说：认为染色体向赤道方向运动，是由于动粒微管牵拉的结果，动粒微管越长，拉力越大，当染色体两侧动粒微管的作用力达到平衡时，染色体被稳定在赤道板上。外推假说：认为染色体向赤道方向运动，是由于星体的排斥力将染色体外推的结果，染色体距离中心体越近，星体的外推力越强。第六十六页，共八十二页。第六十七页，共八十二页。染色体分离后期A和后期B阶段假说后期A：动粒微管的缩短，将染色体逐渐拉向两极。动粒微管的缩短是微管蛋白亚单位去聚合结果。是动力蛋白沿动粒微管向极部运动的结果。后期B：极微管在正端添加微管蛋白亚单位进行聚合延长，使两极的极微管产生重叠的区.KRPs在来自两极的极性微管间搭桥。KRPs向微管正极行走，使极微管间产生滑动，形成将两极分开的力.胞质动力蛋白在星体微管和细胞膜之间搭桥，向星体微管负极运动，进一步将两极拉长.第六十八页，共八十二页。后期A后期B◆力产生的机制：◆后期A，微管去聚合假说◆后期B，纺锤体微管滑动假说◆染色体分离的力●拉力：由动粒微管去装配产生●推力：由极微管的聚合所产生第六十九页，共八十二页。第三节细胞周期的调控美国科学家利兰·哈特韦尔、英国科学家迪莫西·亨特和保罗·纳斯因发现了细胞周期的关键分子的调节作用获得2001年医学生理诺贝尔奖。利兰·哈特韦尔发现控制细胞周期的“start”基因。迪莫西·亨特发现细胞周期的关键调节物质CDK（细胞周期蛋白依赖激酶）保罗·纳斯发现了调节CDK功能的cyclin（细胞周期蛋白）第七十页，共八十二页。一、MPF（成熟促进因子）的发现◆细胞融合与PCC(Prematurechromosomalcondense)1970年，Rao和Johnson将细胞进行同步化培养出不同时期的细胞，将M期细胞与其他间期细胞在仙台病毒介导下融合，并继续培养一段时间，发现与M期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集，称为染色体超前凝集（PCC）；不同时期的间期细胞与M期细胞融合，产生的PCC形态各异。G1+MPCC细单线状S+MPCC为粉末状G2+MPCC双线状第七十一页，共八十二页。人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子；称为细胞促分裂因子(MPF)第七十二页，共八十二页。MPF的发现及其生化实质◆MPF的发现注射实验★用非洲爪蟾分裂中期的卵细胞质提取物注射到非洲爪蟾的卵母细胞，能使卵母细胞进入分裂中期，使核破裂，并形成纺锤体★用细胞间期的提取物注射卵母细胞，不能使卵母细胞进入分裂中期第七十三页，共八十二页。注射实验表明：成熟卵细胞质中，含有促卵母细胞成熟的因子，称做MPF。MPF在细胞周期中波动很大，在有丝分裂前急剧升高，有丝分裂后急剧下降，且普遍存在于动物细胞注射来自M期细胞的细胞质容易检测到的纺锤体注射来自间期细胞的细胞质卵母细胞进入M期卵母细胞不进入M期卵母细胞卵母细胞第七十四页，共八十二页。MPF的纯化工作：进展缓慢，1988年，Maller实验室的Lohka等人分离得到微克级的纯化MPF，证明其含有P32和P45两种蛋白，只有两者结合后，才表现出蛋白激酶活性。第七十五页，共八十二页。P34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系以酵母为材料进行研究cdc基因:与细胞分裂和细胞周期调控有关的基因。对分离的裂殖酵母突变体的研究发现，Cdc2基因是一种重要的基因，缺乏Cdc2基因，细胞停留在G2/M交界处。其表达产物是P34cdc2蛋白，具有蛋白激酶活性。但其激酶活性的表现必须要与另一种蛋白P56cdc13结合。第七十六页，共八十二页。◆芽殖酵母也有一个关键性的基因Cdc28。Cdc28基因突变，细胞停留在G1/S交界处或G2/M交界处。Cdc28基因的表达产物是P34cdc28。是P34cdc2蛋白同源物。◆另一些科学家以海胆卵为材料，发现了细胞周期蛋白(cyclin)第七十七页，共八十二页。MPF由两个不同的亚基组成◆催化亚基是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,其活性依赖于周期蛋白，故被称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependentproteinkinase，Cdks)◆调节亚基：周期蛋白(Cyclin)：其浓度在细胞周期中呈周期性变化◆MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk形成的复合物。

MPF=p34cdc2+cyclin第七十八页，共八十二页。周期蛋白依赖细胞周期蛋白的激酶(Cdk)第七十九页，共八十二页。

SpeciesCdksCyclins

裂殖酵母CDC2(p34cdc2),pucl(G1cyclin)