医学微生物学课件：4-细菌感染的检测方法与防治原则

细菌感染的检测和防治第6章医学微生物学一、细菌感染实验室诊断

KOCH'SPOSTULATES二、细菌感染的防控三、细菌感染的治疗

（细菌耐药性–王明贵教授讲座）KOCH'SPOSTULATESThemicrobemustbepresentineverycaseofthediseaseandnotinhealthyanimalsItmustbeisolatedandgrowninapurecultureThesamediseasemustresultwhentheisolatedmicrobeisinoculatedintoahealthyhostThesamemicrobemustbeisolatedagainfromthediseasedhostDiseaseEtiology:Koch’sPostulatesNotperfect-Koch’spostulatesforidentifyingaviruscausingdisease?-Can

notbecultureinvitro?-Nosusceptibleanimals？-MolecularKoch’spostulates一、细菌感染实验室诊断细菌学诊断-查菌及其成分 -形态学检查染色、形态

-细菌分离培养

-代谢产物生化试验

-抗原检测凝集试验、免疫荧光、ELISA…

-核酸检测PCR，16SrRNA基因测序、芯片…血清学诊断-查患者抗体用已知细菌抗原测病人血清中相应抗体cultureonplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolonymicroscopyDecoloriseCounterstainStainunstainedorstainedwithe.g.Gramstain

sensitivitiesSerodiagnosisDNAtechnologiesbydiscdiffusionmethods,breakpointsorMICsDiagnosisofBacterialInfection临床标本预处理增菌接种培养基，分离单个菌落各种鉴定试验血清学诊断快速诊断试验生化试验血清学实验涂片染色药敏试验动物试验最终诊断报告病原学检验一般程序涂片染色分子检测样本采集非常重要！DiagnosisofBacterialInfectionPatientClinicaldiagnosis

HaematologyBiochemistryNon-microbiologicalinvestigationsRadiologySampleTakethecorrectspecimenTakethespecimencorrectlyLabel&packagethespecimenupcorrectlyAppropriatetransport&storageofspecimen确切的临床评价是合理利用实验室检查的前提-临床判断有误-标本采集错误-实验室检查结果无价值-“垃圾”细菌学诊断标本的采集和送检原则无菌操作，避免污染不同病期所取标本可有不同采集部位-病变明显注意记录、运送和保存快送快检（标本包鲜：床边接种、保菌液）早期采集用抗生素以前采集双份血清研究中的自身对照收集正确的标本

-learnitfrommedicalmicrobiology因感染的不同而定，通常为病人或可疑者的血、尿、粪、痰、脑脊液、脓汁等举例：腹泻-粪便败血症-血呼吸道感染–咽拭子、痰（不是唾液）脑膜炎-脑脊液、血液尿液-中段尿伤寒-不同感染期，不同的标本…影响细菌学检查结果可靠性的因素样本错误（Wrongsample）e.g.salivainsteadofsputum送检不及时/样本储存不当

（Delayintransport/inappropriatestorage）

e.g.CSF样本污染（Overgrowthbycontaminants）

e.g.bloodcultures取样不足/错误（Insufficientsample/samplingerror）e.g.inmycobacterialdisease病人预先使用抗生素（Patienthasreceivedantibiotics）（一）涂片染色镜检:

淋病患者尿道分泌物直接涂片革兰染色脑脊液涂片作革兰染色结核病人痰涂片作抗酸染色深部创口取材涂片染色特殊部位取材，形态染色典型(二)细菌分离培养与鉴定分离培养鉴定是微生物诊断的金标准S.S培养基上伤寒沙门菌-黑色菌落罗氏培养基上结核分枝杆菌-菜花心样菌落亚碲酸钾培养基上白喉杆菌-黑色菌落巧克力色培养基上脑膜炎萘瑟菌-露滴状菌落1.分离培养2.生化试验是鉴定细菌的重要方法之一针对一个菌落或纯培养物进行鉴定细菌的酶系不同，分解底物的能力不同，代谢产物也不同--生物化学方法测定代谢产物，可鉴定细菌-生化试验。124124124124ONPGGLULDCARACITODCH2SUREINDTDAOXNO2＋＋＋＋－＋－－－－－＋7504：肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种7054梅里埃全自动鉴定仪ID32GN生化鉴定条3.血清学鉴定用特异性抗体进行鉴定：种、群、型常用：玻片凝集试验4.动物试验5.药物敏感试验

-纸片法

-稀释法（MIC,MBC）6.自动微生物鉴定和药敏分析系统MIC试管稀释法（三）血清学诊断恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高≥4倍者方有意义种类原理：利用已知抗原检测患者血清中的抗体

(抗原抗体反应)标本：双份血清标本（急性期、恢复期）凝集试验：ELISA试验：补体结合试验：中和试验：（四）细菌核酸的检测聚合酶链反应(PCR)，RT-PCR核酸杂交技术DNA

Southern,Dot,

inSitu

RNA

Northern16SrRNA基因序列分析原核细胞rRNA5S,16S,23S16SrRNA的基因-细菌基因组中拷贝多

-可变区具有属或种的特异性（五）生物芯片技术

基因芯片-核酸

蛋白芯片糖芯片、细胞芯片、组织芯片TypeSizeLargesubunit(rRNAs)Smallsubunit(rRNA)Prokaryotic70S50S5S

:120nt,23S

:2906nt30S16S

:1542ntEukaryotic80S60S5S

:121nt5.8S

:156nt28S

:5070nt)40S18S

:1869ntMultiplesequencesof16SrRNAcanexistwithinasinglebacterium,

highlyconservedbetweendifferentspeciesofbacteria.16SrRNAgenesequencescontainhypervariableregionsthatcanprovidespecies-specificsignaturesequencesusefulforbacterialidentificationRibosomalDatabaseProject,NCBI

核酸分子杂交方法比较：Southern/NorthernblotDotblotInsitu标本DNA/RNA血清组织切片琼脂糖电泳＋硝酸纤维素膜＋＋变性＋＋+探针＋＋+显色反应＋＋+用途诊断分子量测定诊断诊断胞内定位GeneChip/Microarray

AffymetrixGeneChip/Microarrayanimation二、细菌感染的防控控制传染源(患者、带菌者、医源性)切断传播途径提高人群免疫力提高人群免疫力特异性免疫自然主动免疫：传染病、隐性感染被动免疫：经胎盘、母乳由母体输入人工主动免疫：预防接种疫苗、类毒素被动免疫：抗血清

免疫球蛋白（丙种球蛋白）

特异性高效价免疫球蛋白人工主动免疫—疫苗1.菌体疫苗：死疫苗减毒活疫苗2.亚单位疫苗蛋白或抗原成分多糖疫苗：细菌表面多糖成分如脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗。3.基因工程疫苗4.重组载体疫苗5.核酸疫苗（DNA疫苗）6.类毒素（Toxoid）

外毒素经甲醛处理，失去毒性，仍保留免疫原性，人工免疫可刺激产生抗毒素联合疫苗如DPT三联疫苗常用的细菌性疫苗区别死疫苗活疫苗制剂特点死，强毒株减毒疫苗株接种后增殖接种剂量和次数不增殖量较大，2~3次增殖，类似隐性感染量较小，1次免疫维持时间数月~2年维持1~5年甚至更长毒力回复突变安全性疫苗的稳定性不可能相对较高相对稳定有可能对免疫缺陷者有危险相对不稳定保持易保存4℃约1年不易保存，4℃~2周，真空冻干可长期保存死疫苗与活疫苗的区别免疫应答类型体液免疫体液免疫+细胞免疫人工被动免疫用制剂1.抗毒素antitoxin（Fab片段）抗菌血清2.免疫球蛋白(serumgammaglobulin)

血清免疫球蛋白

胎盘免疫球蛋白

特异性高效价免疫球蛋白3.细胞免疫制剂

IFN、IL区别要点人工主动免疫人工被动免疫免疫物质抗原抗体或细胞因子等免疫出现时间慢(注射后2~4周）快（注射后立即）免疫维持时间长（数月~数年）短（2~3周）主要用途预防治疗或紧急预防人工主动免疫与人工被动免疫的区别三、细菌感染的治疗（一）抗菌药物按化学结构和性质分类（P.59）β-内酰胺类（青霉素、头孢菌素类）大环内酯类氨基糖苷类四环素类氯霉素类多肽类抗生素化学合成的抗菌药物（磺胺、喹诺酮、抗结核药）抑菌剂Bacteriostatic

vs

杀菌剂BactericidalBacteriostatic-抑制细菌生长，细菌不死-免疫清除(antibodies,phagocytosisetc)Bactericidal-杀死细菌可能导致细菌细胞成分的释放，引起炎症及用药后续病症

Etest(Epsilometertest)MinimuminhibitoryconcentrationofPenicillinforanisolateofStaphylococcusaureus.MICof0.032µg/ml.36（二）抗菌药物的作用机制（MachanisimofAntibiotics）抑制细菌细胞壁的合成

β-内酰胺类

抑制肽聚糖的合成2.抑制细胞膜的功能

多粘菌素3.抑制细菌蛋白的合成30S亚单位-四环素、氨基糖苷类50S亚单位–氯霉素、红霉素、林可霉素4.抑制核酸合成喹诺酮类5.抑制细菌代谢磺胺类药，复方磺胺甲噁唑MachanisimofAntibiotics4.Inhibitmetabolism1.Inhibitcellwallsynthesis3.Inhibitnucleicacidsynthesis2.InhibitproteinsynthesisRef思考题病原菌检测时，标本采集的注意点？试分析临床标本采集对实验室诊断的重要性。如何分离细菌并进一步鉴定？试述疫苗的主要类型和使用方法？Thanks!细菌细胞壁合成受抑-细菌裂解Sensitivetoosmaticpressure革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架

四肽侧链(varyfromspecies)

五肽交联桥(varyfromspecies)四肽侧链、五肽交联青霉素作用点β-1,4糖苷键溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸D-丙氨酸四肽侧链、五肽交联青霉素作用点DD-transpeptidase青霉素结合蛋白43β-内酰胺类抗生素

BetalactamantibioticsPenicillin(over50compounds)Share4-sidedring(betalactamring)NaturalpenicillinsNarrowrangeofaction,inactiveagainstGram-bacteria,nopenetrationofoutermembraneSusceptibletopenicillinase(betalactamase)opentheb-lactamringofpenicillinsandcephalosporinCephalosporins2nd,3rd,and4thgenerationsmoreeffectiveagainstG-

InhibitorsofCellWallSynthesisSemisyntheticPenicillinsPenicilinase-resistantCarbapenems(碳青霉烯类):broadspectrumMonobactam:Gram-(Neisseria,Pseudomonas)RibosomeastargetsProteinsynthesis；TargetsofantibioticsStreptomycinErythromycinInhibitorsproteinsynthesis46refInhibitorsofDNASynthesis

Quinolones(bactericidal)

nalidixicacid,ciprofloxacin,ofloxacin,norfloxacin,levofloxacin,lomefloxacin,sparfloxacinModeofaction-TheseantimicrobialsbindtothealphasubunitofDNAgyraseandpreventsupercoilingofDNA,therebyinhibitingDNAsynthesis,inhibitbacteria.Resistance-CommonForproteintoxinmediatesdisease–usebacteriostaticproteinsynthesisinhibitortoimmediatelyblocksynthesisoftoxin.QuinolonesBacterialDNA–supercoiledDNAGyraseTopoisomeraseIVBacterialDNAreplicationBacterialDNAreplication

stoped（三）细菌的耐药机制（drugresistance）细菌耐药性的遗传（1）固有耐药性（Intrinsicresistance）（2）获得性耐药

-基因突变

-可传递性耐药

质粒、噬菌体、转座子、整合子

转化、接合、转化（3）多重耐药性

多重耐药（MDR）、交叉耐药

泛耐药（XDR，

Pandrugresistance）2.细菌耐药的生化机制(1)钝化酶（modifiedenzyme）的产生β-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素乙酰转移酶(2)药物作用靶位的改变(3)抗菌药物的渗透障碍-细胞壁(4)主动外排机制-细菌外排泵(5)细菌生物膜Penicillinase(bLactamase)

-producedbysomebacteria--resistancetobeta-lactamantibioticslikepenicillins,cephamycins,andcarbapenems(ertapenem)Penicillins+-lactamaseinhibitors(Clavulanate,sulbactam,andtazobactam)Clavulanate(Clavulanicacid)sulbactamtazobactam52

βlactam(βlactamasesinhibitor)bindsstronglytoβlactamasesinhibitsβlactamasesactivityNodirecteffectsonbacterialimitedpotencyasantibioticusedinconjunctionwithotherβlactamsClavulanicacid

AntibioticsresistantResistantimmuneclearanceReleasedintobloodstream-Septicemiarelapse

BacterialbiofilmResistantgene?Barrier?ExpressionalteredAntibioticsresistant>100-1000foldthanplanktoniccellsGeneticexchangeofantimicrobialresistancegenes

耐药可在细菌种内或种间传递EnterobacteriaceaeEnterococciStaphylococciPseudomonasCampylobacterVibriocholeraePneumococciStreptococci抗菌素治疗的基本原则：根据患者情况、病原、抗菌药物特点综合考虑1.细菌感染的诊断，选择合适的药物2.尽早查明病原，药敏3.按照抗菌作用特点、感染特点、药物代谢选择用药4.药物剂量要合适5.可联合用药，或交替用药CombinationtherapyAspenicillinsandbacteriostaticantibioticsPreventemergenceofresistantstrainsTemporarytreatmentuntildiagnosisismadeTakeadvantageofantibioticsynergismPenicillinsandaminoglycosidesinhibitcellwallsynthesisandallowaminoglycosidestoenterthebacteriumandinhibitproteinsynthesis.CAUTION:AntibioticantagonismCellwallsynthesisisnotoccurringincellsthatarenotgrowingWHOGlobalPrinciplesForTheContainmentofAntimicrobialResistanceInAnimalsIntendedforFoodDepartmentforCommunicableDiseasesSurveillanceandResponseWorldHealthOrganizationReportofaWHOConsultationwiththeparticipationoftheFoodandAgriultureOrganizationandtheOfficeInternationaldesEpizootiesGeneva,Switzerland5–9June2000WHO/CDS/CSR/APH/2000.4Distr.:GeneralEnglishonlyManualforthelaboratoryIdentificationandAntimicrobialSusceptibilityTestingofBacterialPathogensofPublicHealthImportanceintheDevelopingWorld

WHO/CDS/CSR/RMD/2003.6/csr/resources/publications/drugresist/WHO_CDS_CSR_RMD_2003_6/en/RefRefCharacteristicBacteriaSpirochetesMycoplasmaChlamydiaintracellularRickettsiaintracelluarSize(mm)0.5~3.06~200.2~0.30.2~0.40.3~0.5CellwallyesyesNoyesyesCellwallcompositionsCellwallwithpeptidoglycanOutermembrane+cellwallSterolinthecellmembraneSimilartoG

-bacteriaSharecommonantigenwithB.proteusMultiplicationBinaryfissionBinaryfissionBinaryfissionIntracellular,BinaryfissionIntracellular,BinaryfissionFiltration--+++MajorCategoriesofBacteriaSensitivetowhatkindofantibiotics?Ribosome70S70S70S70S70S60MechanismsofAntibioticsTargetantibioticsSpectrum(NarroworBroad)BacterialinfectionsMechanismsofdrugresistantInhibitcellwallsynthesisInhibitproteinsynthesisInhibitnucleicacidsynthesisInhibitmetabolismMechanismsofdrugresistant(outlines,youmayaddmoredetails):1.Alteredpermeability2.Inactivationoftheantibiotic3.Mutationinthetargetsite.4.ReplacementofasensitiveenzymewitharesistantenzymeHowtostudyantibioticsanddrugresistant(youmayhandthehomeworkbeforethemidtermexams)61KeyWordsIsolation(culture)Agarplateplate/coloniesLiquidmediaIdentification&t