松材线虫病检测技术

松材线虫病检测技术一、室内检验a、抽样和取样：在调运检疫时抽取有上述症状的部分检疫物，抽样数量为每批次总件数的0.5-5.0%，但最低不得少于5件。若无明显症状时可随机抽样。在进行病害调查时，则选取有松材线虫病症状的样株，根据具体情况砍取木段或钻取木屑进行室内检验。在所选取的样木（样品）或样株上钻取少量木屑约10g，每样3个重复。取样时要注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。对所取样品标号后带回实验室检验。必要时可将整件样木(或样品)带回实验室备检。b、分离线虫：将各标号样品分别进行线虫分离。分离线虫可采用贝尔曼(Baermann)漏斗法或浅盘法。对媒介昆虫进行线虫分离时，可将其用剪刀或尖头镊子、解剖针等剪碎或撕碎后同样采用上述方法进行。分离时若室温较低(不得低于7℃)可根据室温高低将分离用水调至20—40℃(不得超过40℃)后浸泡分离材料，3—4小时线虫游离出一定数量后即可镜检。一般情况24小时后镜检。贝尔曼(Baermann)漏斗法：将大小适当(直径10—15cm)的漏斗末端接一段长约10cm的乳胶管后置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹。剪大小适当纱布两层铺在漏斗上。将带到实验室的样段去皮后劈成长约3—4cm的细条或钻取木屑，约取小木条(或木屑)10g置于漏斗上的纱布中，将纱布四角向中间盖上分离材料，然后注入清水浸没。注入清水后要注意使水充满漏斗和下面的乳胶管，不要产生空隙。镜检时，用培养皿在漏斗末端接取线虫分离液约5—15ml即可。c、镜检：分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体检验，观察它的一般形态结构。然后尽量选择几条成熟、特征易观察的线虫，用针或吸管移至载玻片上的水滴中，使之沉底。将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次，约5—6秒至虫体突然伸直时停止，加盖玻片后在显微镜下观察。根据形态特征予以鉴别，以确定其是否为松材线虫。分别记录检验结果。记录的主要内容和形式可参照松材线虫检验记录表。（3）鉴定临时玻片的制作a、杀死和固定：将盛有线虫悬浮液的小烧杯置于65℃水浴中2分钟杀死线虫，经离心浓缩后即用三羟基乙胺福尔马林固定液(TAF)固定。b、制片：在洁净的载玻片上滴1小滴水，水滴大小以加盖玻片后恰好充满盖玻片下的空间为宜。在解剖镜下挑选经固定后的雌雄成虫各两条，摆在水滴中并使其沉没，从水滴的一侧缓缓加上盖玻片，避免出现气泡，用熔化的蜡烛或指甲油封片。（4）鉴定标准分类地位：松材线虫BursaphelenchusxylophtIlus(SteineretBukrer)NickJe属滑刃科(Aphelenchoididae)，伞滑刃属(Bursaphelenchus)。它与滑刃属(Aphelenchoides)的线虫很相似。在形态上两个属的主要区别是伞滑刃属线虫的雄虫尾部为一小的交合伞所包裹，而滑刃属线虫的雄虫无此交合伞形态特征：成虫虫体细长，约lmm。头部唇区高，溢缩显著，口针细长，基部略微增厚，使口针基结清晰。中食道球卵圆形，占体宽的2/3以上，食道腺细长叶状，覆盖于肠背面。排泻孔的开口大致和食道与肠交接处平等。半月体在排泻孔后约2/3体宽处。雌虫热杀死后体态呈开阔“C”形。尾部亚圆锥形，末端钝圆，少数有微小的尾尖突(不超过2微米)。卵巢1个，前伸，卵呈单行排列，阴门开口于虫体中后部约73%处，开口处有后伸的宽的阴门前唇(阴门盖)覆盖。后子宫囊长，约为阴肛距的2/3。雄虫热杀死后体呈“J”形，尾端尖细，侧观呈爪状，向腹部弯曲，为卵形交合伞所包裹(腹面观)。交合刺大，弓状，成对，喙突显著，交合刺远端膨大如