第6章糖代谢与控制

第一节糖代谢与调节微生物分解葡萄糖可归纳为有氧降解和无氧降解两大类型。葡萄糖有氧降解途径的最终产物是CO2和H2O，同时产生组成细胞物质的中间产物和大量的能量。主要包括EMP、TCA、HMP途径。葡萄糖的无氧降解的产物为各种有机酸、醇和气体（CO2和H2），主要包括EMP、HMP两种基本方式。第一页，共六十六页。一、EMP途径EMP途径是生物界共有的。在该途径中，葡萄糖被转化为F-1,6-2P后开始降解成PYR，包括10个独立的，但又是连续的反应。PFK是EMP途径的关键酶，受ATP、O2、柠檬酸的抑制，为AMP所激活。第二页，共六十六页。葡萄糖经EMP途径降解成丙酮酸的总反应式为：C6H12O6+2NAD++2Pi+2ADP→2PYR+（NADH+H+）+2ATP在无氧条件下，如以乙醛作为受氢体，即是酒精发酵，如以丙酮酸作为受氢体，即是乳酸发酵。第三页，共六十六页。二、HMP途径葡萄糖在转化成6-磷酸葡萄糖酸后就分解成为CO2和5-磷酸核酮糖，也就是在单磷酸己糖的基础上开始降解的。因此常称为单磷酸己糖途径，即HMP途径。这条途径的主要特点是：⑴葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经过三碳糖阶段。⑵只有辅酶Ⅱ（NADP+）参与反应。HMP途径的总反应式为：G-6-P+12NADP++7H20→6CO2+12(NADPH+H+)+Pi第四页，共六十六页。HMP途径的生物学意义：⑴HMP途径是细胞产生还原力（NADP）的主要途径。⑵HMP途径是细胞内不同结构糖分子的重要来源，并为各种单糖的相互转变提供条件。第五页，共六十六页。ED途径主要存在于假单胞菌（Pseudomonassp.）等少数革兰氏阴性菌。ED途径特有的酶是KDPG醛缩酶。它催化己糖裂解为三碳化合物的反应。ED途径的总反应式为：Glc+ADP+NADP++NAD+→2PYR+ATP+NADPH+2H++NADH三、ED途径第六页，共六十六页。第七页，共六十六页。四、TCA循环三羧酸循环又称柠檬酸循环，简称为TCA循环，也称Krebscycle。丙酮酸氧化脱羧产物乙酰CoA与草酰乙酸（三羧酸循环中与乙酰CoA结合点）结合生成柠檬酸进入循环。在循环过程中，乙酰CoA被氧化成H2O和CO2，并释放出大量能量。第八页，共六十六页。第九页，共六十六页。生物氧化葡萄糖在有氧条件下的分解过程，包括3个环节：①底物的脱氢作用；②氢或电子的传递；③受氢体接受氢。五、电子传递系统与氧化磷酸化第十页，共六十六页。第十一页，共六十六页。第十二页，共六十六页。六、糖代谢的调节1、能荷调节糖代谢的调节主要是受能荷的控制，也就是受细胞内能量水平的控制。糖代谢最重要的生理功能是以ATP的形式供给热量，在葡萄糖氧化过程中，中间产物积累或减少，进而引起能荷的变化，造成代谢终产物ATP的过剩或减少。这些中间产物和腺嘌呤核苷酸通过抑制或激活糖代谢各阶段关键酶的活性来调节能量的生成。第十三页，共六十六页。第十四页，共六十六页。能荷（Energycharge）：[（ATP）+1/2（ADP）]/[（ATP）+（ADP）+（AMP）]当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内ATP分解生成ADP和AMP。一旦ATP减少，ADP或AMP增加，即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制糖原合成的酶，从而加速糖酵解，TCA循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。当能荷高时，即细胞内能量水平高时，AMP、ADP都转变成ATP，情况则相反。第十五页，共六十六页。2、生物素的调节生物素对糖酵解的影响，主要是解糖速度，而不是EMP/HMP的比率。当生物素充足时，解糖速度显著提高，比PYR进一步氧化速度提高得快，造成乳酸积累。当生物素缺乏时，由于NAD水平降低的结果，间接地引起四碳二羧酸氧化能力下降。第十六页，共六十六页。生物素充足和缺乏条件下，丙酮酸代谢的推测途径。第十七页，共六十六页。第十八页，共六十六页。第二节D-核糖发酵一、D-核糖（Ribose）概述D-核糖在体内具有重要的生理功能，参与多种新陈代谢活动，是生物体内遗传物质基础RNA、DNA及若干辅酶和维生素的组成成份。在医药上，D-核糖本身作为药物用于治疗心肌缺血、运动导致的肌肉疼痛。作为医药中间体，D-核糖是大规模合成核黄素、病毒唑的主要原料，可大幅度降低生产成本。在食品工业中可以作为调味品、调味香料等合成原料。第十九页，共六十六页。在自然界中，D-核糖不以单体存在，长期以来一直作为昂贵的生化试剂，国内需求主要依靠进口。用微生物发酵法可大规模生产D-核糖，价格低廉，解决了核黄素、病毒唑等药物的原料来源，市场应用前景非常乐观。采用生物技术发酵法生产D-核糖成本低、污染小，是当前最为经济有效的D－核糖生产方法。目前国际市场上D-核糖价格是30～40美元/千克，发酵法生产D-核糖成本约在人民币150～200元/kg，属于高附加值产品。第二十页，共六十六页。二、D-核糖的生物合成途径第二十一页，共六十六页。葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下先生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），并继续由6-磷酸-D-葡萄糖脱氢酶催化转化为6-磷酸-D-葡萄糖酸（6-P-D-Gn）(主要途径）；G也可以在葡萄糖脱氢酶的作用下生成D-葡萄糖酸（Gn），经葡糖酸激酶的催化生成6-P-D-Gn（次要途径）。所生成的6-P-D-Gn在6-磷酸葡糖酸脱氢酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸（D-Rn-5-P）。D-Rn-5-P在5-磷酸核酮糖差相异构酶的作用下生成D-木酮糖-5-磷酸，也可在5-磷酸核糖异构酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸，后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物D-核糖。第二十二页，共六十六页。三、D-核糖的发酵机制D-核糖发酵是切断HMP途径，使微生物改变酶系，积累阻断反应的前体物，进行代谢控制发酵的典型例子。第二十三页，共六十六页。第二十四页，共六十六页。由上面的代谢途径可以看出，要使微生物积累D-核糖，必须选育丧失转酮酶活力的突变株，由于缺少转酮酶，所以由转酮酶所催化的反应就会发生阻断，使D-核糖的前体物D-核糖-5-磷酸大量积累，再经酶的作用脱去磷酸便可合成D-核糖。第二十五页，共六十六页。四、D-核糖发酵的代谢控制育种1、出发菌株的选择研究发现，芽孢杆菌属（Bacillus）细菌转酮酶缺陷突变株积累核糖具有普遍性。使用不同的亲株，虽然选育出同样的突变型，但产物的种类也会有所差异。如芽孢杆菌属细菌积累戊糖的现象是很普遍的，而大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等细菌的突变株不积累戊糖。因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。第二十六页，共六十六页。2、转酮酶缺陷突变株的分离分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：⑴选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株。D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖必须通过HMP途径进行代谢。若转酮酶发生缺陷，菌体自然也就不能利用D-葡萄糖或L-阿拉伯糖。第二十七页，共六十六页。第二十八页，共六十六页。⑵选育莽草酸缺陷突变株。莽草酸是由HMP途径中的中间产物——D-赤藓糖-4-磷酸与PEP为前体物而合成的。若转酮酶发生缺陷，则D-赤藓糖-4-磷酸合成受阻，也就不会合成莽草酸。第二十九页，共六十六页。第三十页，共六十六页。⑶选育L-Trp缺陷、L-Tyr缺陷、L-Phe缺陷、CoQ缺陷、维生素K缺陷或叶酸缺陷突变株。原理同莽草酸缺陷突变株。第三十一页，共六十六页。3、其它标记据报道，在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变，使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力等标记，可使菌体的D-核糖积累量大幅度提高。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属细菌的孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2会发生分子型的变换，结果在菌体对数生长期被诱导，导致D-核糖的大量积累。第三十二页，共六十六页。4、利用基因工程技术构建核糖工程菌株岩盾等人将枯草芽孢菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒pUB110中，再将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活。经限制性内切酶酶切后得到线状重组质粒，将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主中，构建出转酮酶失活的D-核糖工程菌株，其D-核糖积累量达52g/L。第三十三页，共六十六页。小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到穿梭载体质粒pHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中，构建出D-核糖工程菌株，能积累49g/LD-核糖。第三十四页，共六十六页。5、发酵控制D-核糖的发酵培养基的碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。有机氮源可以使用干酵母、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆等。为促进生长，尚需添加少量(NH4)2SO4，同时加入适量的CaCO3，以便中和发酵过程中生成的SO42-。由于葡萄糖生成核糖的反应酶系与3个脱氢酶有关，所以，核糖发酵在好气条件下进行。一般要求pH中性，温度37℃左右。第三十五页，共六十六页。第三十六页，共六十六页。第三节柠檬酸的发酵机制一、概述柠檬酸的应用

柠檬酸（Citricacid）又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

第三十七页，共六十六页。1)

饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料。柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。第三十八页，共六十六页。2)

果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。第三十九页，共六十六页。3)

腌制与罐头食品

各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。第四十页，共六十六页。4)

其它在医药工业中，柠檬酸作为抗凝血剂，可防止血液中凝血的产生。还可用于生产柠檬酸钠作输血剂。在化学工业中，柠檬酸三乙酯、三丁酯可作肥皂或香皂的添加剂，柠檬酸锌可作为微量元素肥料使用。在洗涤剂工业中，柠檬酸在无磷酸盐洗衣粉、液体洗涤剂等配方中使用，可代替三聚磷酸钠，增强洗涤剂的去污能力。第四十一页，共六十六页。柠檬酸的消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。第四十二页，共六十六页。柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸；我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万吨；欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨；美国柠檬酸年产量约25万吨。第四十三页，共六十六页。二、柠檬酸发酵机理1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。第四十四页，共六十六页。

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉分生孢子头第四十五页，共六十六页。第四十六页，共六十六页。Ⅰ柠檬酸合成途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶第四十七页，共六十六页。第四十八页，共六十六页。第四十九页，共六十六页。Ⅱ柠檬酸合成的调节㈠糖酵解途径的调节第五十页，共六十六页。第五十一页，共六十六页。第五十二页，共六十六页。柠檬酸的积累机制归纳为：第五十三页，共六十六页。第五十四页，共六十六页。第五十五页，共六十六页。三、高产柠檬酸菌株的特征黑曲霉主要特征有：在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性淀粉酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；第五十六页，共六十六页。能抗微量金属离子，特别是抗Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+等金属离子；在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少产生ATP。第五十七页，共六十六页。第五十八页，共六十六页。四、柠檬酸发酵的代谢控制育种1、出发菌株的选择产生柠檬酸的微生物很多，工业生产上应用的，以糖或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、温氏曲霉、米曲霉、灰绿曲霉、金黄曲霉等，特别是黑曲霉，在工业生产上产酸已达20%以上，对糖的转化率可达90%以上。在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母。第五十九页，共六十六页。2、选择透明圈大的突变株培养基（10%甘薯粉，2%琼脂）中加入0.5%CaCO3，制成平板。黑曲霉诱变后在