一株生物乳化剂产生菌的筛选及其特性研究

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材料与方法

2.1土壤样品

本测验所用土样采集自滨州地区石油开采区。

2.2测验材料

富集培养基[7，8]：K2HPO44.35g，KH2PO41.7g，NH4CL2.1g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl2·2H2O0.03g，石蜡5%。

发酵培养基[7，8]：K2HPO4·3H2O4.8g，KH2PO41.5g，（NH4）2SO41g，柠檬酸三钠0.5g，MgSO4·7H2O0.2g，葡萄糖2g，酵母提取物0.1g，CaCl2·2H2O0.002g，MnCl2·4H2O0.0004g，NiCl·6H2O0.0004g，ZnSO4·7H2O0.0004g，FeCl3·6H2O0.0002g，NaMoO4·2H2O0.0002g，pH值7.2蒸馏水1000mL。

2.3生物乳化剂产生菌的富集和纯化

称取定量土样于液蜡培养基中举行富集。培养温度37℃，180r/min，摇床震荡培养，时间7d，富集3～5次。将富集液举行稀释涂布，培养基采用LB培养基分开纯化。将分开得到的菌株举行分开纯化以备后期乳化性能的测定。

2.4乳化性能的测定

将分开到的菌株接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min摇床过夜培养。在试管中参与3mL柴油作为测试烃和7mL培养液，涡旋振荡器充分振荡1min，静止2h，以乳化指数（EI24=乳化层高度/有机相总高度）[9，10]表示乳化剂的乳化活性。

2.5菌株的鉴定

2.5.1生理生化回响检测

参考常见细菌系统鉴定手册测定。

2.5.2菌株16SrRNA鉴定

将筛选得到的菌株举行DNA的提取后，利用细菌16SrRNA基因通用引物27F和1492R来扩增16SrRNA基因序列。PCR回响体系的回响条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延迟1min，30个循环，72℃延迟10min[11]。扩增产物经电泳检测后送北京生物工程公司检测。序列用于系统发育树作图。

2.6产生物乳化剂菌株最适生长条件分析

将分开得到的目的菌株接种到发酵培养基中，37℃，180r/min摇床震荡过夜培养后测定其对柴油的乳化作用。将发酵培养基的初始pH值分别调为7、8、9、10、11、12，初始盐浓度调为0%～9%，接种目的菌株，37℃，180r/min摇床震荡过夜培养后测定其乳化指数及在600nm波长下的OD值，以未接菌的空白培养基作为对照[12]。

2.7生物乳化剂的分开

将目的菌株举行发酵培养，发酵液经10000r/min离心10min，除去菌体。上清液中缓慢参与（NH4）2SO4至75%饱和度，4℃冰箱过夜沉淀。9000r/min离心15min除去上清，沉淀重溶于少量蒸馏水，经冷冻枯燥后获得絮状固体即为乳化剂粗制品[13]。

2.8生物乳化剂理化性质分析

（1）乳化剂的乳化浓度范围：将乳化剂样品溶于ddH2O中，分别稀释为5mg/L、4.5mg/L、4mg/L、3.5mg/L、3mg/L、2.5mg/L、2mg/L、1.5mg/L和1mg/L，检测其乳化活性，测试乳化剂作用浓度范围。

（2）生物乳化剂的糖类组分的定性检测采用硫酸-蒽酮显色法，脂类组分的定性检测采用钼酸铵一高氯酸显色法，蛋白质组分的定性检测采用水合茚三酮显色法。根据苯酚-硫酸法、氯仿/甲醇法、考马斯亮蓝法对乳化剂中糖、脂和蛋白含量举行定量测试。

3结果与分析

3.1菌株的分开筛选

经过富集培养和分开纯化，从滨州地区石油开采区的石油污染土壤中分开获得4株菌，其中菌株SJ在发酵培养基中产乳化剂才能最强，乳化指数为100%（图1）。

3.2菌株SJ的鉴定

菌株SJ在LB平板上的菌落呈圆形，边缘整齐，产色素，橘黄色。革兰氏染色呈阴性，菌体近球状，不产芽孢，无荚膜。生理生化检测说明，该菌株为兼性好氧菌，甲基红试验为阴性，不水解尿素，能利用柠檬酸盐，淀粉水解与纤维素水解为阴性，V-P试验为阴性。提取其基因组，并扩增16SrRNA基因，经测序得到1500bp左右的基因序列，与NCBI中的序列举行比对察觉该菌株与菌株Serratiasp.SCH-1（KJ584612.1）同源性最高（图2），序列好像性为99%，初步判定菌株SJ属于沙雷氏菌属，命名为Serratiasp.SJ。

3.3SJ菌株的最适生长条件

测试了菌种SJ在不同的pH值条件下、不同NaCl浓度下的生长处境，结果察觉菌株SJ在pH值7～12的范围内都能够生长，最适生长pH值为8.0；在NaCl浓度为0～4%的范围内生长良好（图3、图4）。

3.4菌株SJ产生物乳化剂的发酵时间

在菌株SJ发酵培养的最适条件下举行发酵培养，每隔2h，取菌液测定乳化指数，结果如图5所示，菌株生长22h以后，发酵液的乳化指数达成100%。

3.5菌株SJ产生的生物乳化剂的提取

发酵培养SJ菌株，将发酵液离心除去菌体，将上清用饱和（NH4）2SO4至举行沉淀，4℃冰箱过夜沉淀，9000r/min离心15min除去上清，将沉淀透析后冷冻枯燥。2L发酵液中提取出乳化剂1.5g，得率为0.75g/L。

将得到的生物乳化剂配制成不同浓度的样品，分别测试乳化才能，如图6所示，结果说明乳化剂浓度大于2mg/mL乳化指数均为100%，说明有效提取了菌株SJ产生的生物乳化剂。

3.6菌株SJ产生的生物乳化剂的定性定量分析

对菌株SJ产生的生物乳化剂举行定性和定量分析，采用硫酸-蒽酮显色法检测察觉，生物乳化剂样品和对照组（D-果糖）均呈现蓝绿色，表示该生物乳化剂中含有糖组分；水合茚三酮显色测验中，乳化剂样品呈现粉红色，表示该生物乳化剂中含有蛋白质成分；钼酸铵-高氯酸显色回响中察觉样品和对照组（橄榄油）均呈现蓝黑色回响，表示该生物乳化剂中含有脂质成分。定量分析结果说明，三种组分的含量分别为34.7%、41.6%和16.0%。

4结论

本测验从石油污染盐碱土中分开得到一株产生物乳化剂的菌株SJ，经鉴定该菌株属于沙雷氏菌。该菌株对pH值与盐度均有很强的耐受性，pH值耐受范围为7