漆酶的固定化,实验方案

树脂是工业中使用得比较广泛的材料，它价格低廉、机械强度好、物化性能稳定、容易再生，用作固定化酶的载体将会有很好的发展前景。离子交换树脂是一类不溶也不熔且具有三维空间网状骨架结构亲水性的功能高分子。连接在树脂骨架上的功能基，可通过吸附、共价键、离子键、配位键、交联、微胶囊等形式以及其他手段将酶固定在树脂上，构成固定化酶［65］。树脂D380是一种浅黄色球形大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上带有伯胺基，属于反应性高分子材料。该树脂表面的功能基团-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反应生成西弗(Schiff)碱，而戊二醛的另一个醛基可以连接酶蛋白中游离的-NH2,因此达到固定化酶的目的。2.1实验部分2.1.1实验仪器和试剂2.1.1.1.实验仪器试验中用到的主要实验仪器见表2.1。气浴恒温振荡器 THZ-92B型数显恒温水浴锅 HH-S型电子分析天平 AB204-N型紫外一可见光分光光度计 VIS-7220G循环水真空泵 SHI-III型2.1.1.2.实验试剂主要实验试剂见表2.2。真菌漆酶>20u/mg树脂D380戊二醛分析纯邻联甲苯胺分析纯醋酸分析纯醋酸钠分析纯碳酸氢二钠分析纯

分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯氢氧化钠盐酸2.1.2实验方法2.1.2.1树脂D380的预处理取一定量的树脂，去离子水浸泡24h,然后用5%HCL浸泡12h,洗涤全中性后再用2%的Na0H浸泡12h,再次洗涤全中性，最后以去离子水浸泡备用。2.1.2.2漆酶的固定化首先，采用两种方法路线固定化漆酶：先用戊二醛交联载体后再吸附漆酶和先用载体吸附漆酶后再用戊二醛交联，分别测定两种方法固定化漆酶的活力，流程见图2.1所示。其中戊二醛浓度为2%(V:V)，加入量为20mL，缓冲溶液为5mLpH为5.5的醋酸缓冲溶液，酶液为10mL浓度1mg/mL的稀释酶液。实验结果表明前者效果明显优于后者，因此后续实验均采用此法进行。漆酶的固定化方法:取适量预处理过的树脂，抽滤去除表面水分，称取1g置于50ml圆底烧瓶中，加入20ml0.7%(V:V)的戊二醛，在4°C下搅拌反应2h后静置过夜，再用蒸馏水洗涤多次(至少5次)，去掉未交联的戊二醛，然后加入5mlpH为4的醋酸一醋酸钠缓冲液和2mL稀释酶液在振荡器中在25C振荡反应6h，反应后放在冰箱于4C下静置一夜，洗涤多次(至少5次)去除未固定化的漆酶，并测定固定化漆酶酶活。

图2.1两种固定化方法的流程图2.1.2.3漆酶活性的测定根据实验条件，本文以邻联甲苯胺做底物，采用紫外分光光度法测定该真菌漆酶的酶活力。自由漆酶活力的测定方法【72】：按照表2.3所示，加入各试剂于比色管中，在25^的恒温水浴中保温30min,以煮沸灭活的方式终止反应，在VIS-7220G型紫外一可见分光光度计上按表1所示波长测定吸光度值。定义每分钟引起0.0l吸光度值变化所需的酶量为一个酶活力单位(U/mg)。同时做3个平行样，一个空白样(0.1ml酶液换为蒸馏水),结果计算取平均值。表2.3.漆酶活力测定底物缓冲液漆酶用量测定波长0.5ml3.36mM邻联甲苯胺3.4ml0.1M,pH4.6醋酸-醋酸钠溶液0.1ml0.1mg/ml漆酶溶液600nm固定化酶活的测定：称取50mg固定化漆酶于比色管中，加入表2.3中的底物和缓冲液，在气浴恒温振荡器中25°C下振荡30min,取上清液测其在600nm处的吸光度值，计算每克载体的酶活(u/g)。同样做3个平行样，一个空白样，结果取平均值。固定化漆酶的酶活活回收率按照下式计算：酶活回收率(％)二固定化漆酶的总酶活/所用自由漆酶的总酶活2.1.2.4漆酶的米氏常数Km的测定按照测定自由酶和固定化酶的方法，配制不同浓度的底物，反应后测定吸光度值A，以吸光度值的倒数1/A代表其反应速度的倒数1/V作为纵坐标，以底物邻联甲苯胺的浓度倒数1/S为横坐标，作图以求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.2.2漆酶固定化条件优化酶的固定化率受固定过程中各个因素的影响比较大，如交联剂用量、交联反应时间、酶用量、酶吸附时间、吸附温度、pH值等。对这些因素进行优化研究，以得到固定漆酶的最佳条件。2.2.2.1戊二醛浓度对固定化漆酶的影响按照2.1.2.2的固定化方法，选择戊二醛的浓度为0.1%、0.3%、0.5%、O.7%、0.9%和1%(v:v)，交联反应4出加入pH=5.5的醋酸一醋酸钠缓冲溶液和5mL酶液，振荡反应6h。将结果画成折线图戊二醛是交联剂，能够与载体和漆酶的氨基发生反应生成西弗(Schiff)碱【30】，随着浓度的增加，固定在载体上的漆酶是增加的。但是，戊二醛也能使漆酶变性【571,达到一定浓度时，反而使漆酶因失活而回收率下降。2.2.2.2交联时间对固定化漆酶的影响戊二醛浓度为0.7%,交联时间分别为2、4、6、8、l0和12h,其他条件不变，测定固定化漆酶活力，作图 酶活回收率下降，可能是由于戊二醛对漆酶的失活作用所致。随着交联时间的延长，固定化漆酶的酶活回收率变化不大，说明戊二醛与载体上氨基的反应已经饱和。2.2.2.3漆酶用量对固定化漆酶的影响按照以上的固定化方法，漆酶用量取1、2、3、4、5和6ml。作图。当给酶量一定时漆酶的游离氨基与载体上游离醛基的反应达到饱和2.2.2.4吸附时间对固定化漆酶的影响当给酶量为2ml，吸附时间分别为2、4、6、8、10、和12h时，测定固定化漆酶的酶活回收率。作图。 随着时间增加，酶活回收率先增加后降低，在最高点时吸附达到饱和，再增加吸附时间，由于振荡会使吸附在载体上未反应的漆酶掉落，酶活回收率降低。2.2.2.5温度对固定化漆酶的影响按照以上的固定化方法，设定吸附温度为15、20、25、30、35和40°C，测定漆酶活力，作图。2.2.2.6pH值对固定化漆酶的影响吸附温度设为25C，加入缓冲液的pH分别为3、3.5、4、4.5、5、5.5和6时，观察固定化酶的酶活回收率变化，作图。2.2.3.红外分析树脂D380是一种浅黄色球形大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上带有伯胺基，属于反应性高分子材料。该树脂表面的功能基团-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反应生成西弗（Schiff）碱，而戊二醛的另一个醛基可以连接酶蛋白中游离的-NH2,因此达到固定化酶的目的。将戊二醛交联后和固定化漆酶后的载体做红外光谱检测图中3400cm处的强峰为-OH和-NH2的伸缩振动峰，2920cm附近的吸收峰均为C-H的伸缩振动峰2.2.4.1固定化漆酶的最适温度在不同的温度下测定固定化漆酶的活力，如图2.10所示，15〜20°C为固定化漆酶的最适温度范围，30C以后酶活力损失较大，说明该形式的漆酶在过高的温度下容易失活。相对于自由漆酶的最适温度30C，固定化漆酶的最适温度有所下降。2.2.4.2固定化漆酶的最适pH在不同的pH（3—6为CH3COOH-CH3COONa溶液，7—8为NaH2P04-Na2HP04溶液）下测定固定化漆酶的活力，如图2.11所示，可见该固定化漆酶的最适pH为4，比较适合酸性环境，当pH大于5时，酶活力损失较大。2.2.4.3两种形式漆酶的储存稳定性比较将自由漆酶和固定化漆酶在4C下存放两周，定期分别测定其酶活力，结果见图2.12。由图可见，固定化漆酶的储存稳定性较好，在两周后还有约80%的相对酶活，而自由漆酶仅为50%。由此可见，固定化漆酶的储存稳定性大大提高。2.2.4.4两种形式漆酶的米氏常数Km按照测定自由酶和固定化酶的方法配置不同浓度的邻甲联苯胺（0.1、0.2、03、0.4和0.5mmol/L）作为底物测定反应后的吸光度值A，以吸光度值的倒数1/A代表其反应速度的倒数1/V作为纵坐标，以底物邻联甲苯胺的浓度倒数1/S为横坐标，依照Lineweaver一Burk图解法求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.3本章小结树脂的诸多优点使其成为工业上广泛使用的材料。用离子交换树脂D380已经成功地固定了胰蛋白酶【75】和果胶酶‘651，而用其固定漆酶尚未见报道。本章以树脂D380为载体，戊二醛为交联剂固定化漆酶，得到最佳固定化条件为：戊二醛浓度0.7%,交联时间2h,加酶量2mL,吸附时间6h,固定化温度25°C,pH为4,最终得到的酶活回收率为65.94%。在最佳条件下得到的固定化漆酶的最适温度为20C,最适pH为4,在4C下保存两星期仍保持约80%的酶活，而自由漆酶仅为