2023年兽医生物制品作业

免疫佐剂及其研究进展摘要：免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反映类型的物质。1925年，法国兽医免疫学家Ramon一方面观测到在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体抵抗反映。1926年，Glenny最先将铝化合物作为免疫佐剂应用于白喉外毒素疫苗。1951年，Freund将液体石蜡与羊毛脂（乳化剂）按一定比例混合后，加入抗原研制成油包水的乳胶，免疫动物后效果极佳，可产生高效而持久的抗体。1956年，Johnson发现革兰氏阴性细菌的内毒素具有佐剂活性。此后,许多国家都不同限度地开展了这方面的研究。目前正在开发的新型疫苗有合成肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、转基因植物口服疫苗等，这些新型疫苗具有良好的抗原特异性和低毒性。但由于其抗原分子小，纯化限度高，疫苗的免疫原性较差，所以需要安全有效的佐剂来增强疫苗的效力。近年来佐剂的发展迅猛，多种新型佐剂层出不穷，人们对佐剂的作用机理亦有更进一步的结识。关键词：佐剂；免疫应答反映；疫苗；免疫原性1免疫佐剂作用机理

Cox等提出佐剂增强免疫应答5种也许的机制：免疫调节，抗原提呈，诱导CTL，靶向传递和抗原储存。佐剂增强免疫应答的机制尚未完全阐明，其作用机制涉及：①在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，延长抗原在局部组织内的滞留时间，较长时间使抗原与免疫细胞接触并激发对抗原的应答。②增长抗原表面积，提高抗原的免疫原性，辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位递呈给免疫细胞。③促进局部的炎症反映，增强吞噬细胞的活性，促进免疫细胞的增殖与分化，诱导细胞因子的分泌。

2佐剂的种类

2.1铝佐剂铝作为疫苗佐剂已使用70余年,它为疫苗的免疫效率等诸多方面问题的解决起到了重要的作用.铝佐剂的作用是在组织中形成抗原贮藏库;产生颗粒性抗本来促进抗原提呈给免疫细胞;使抗原滞留,缓慢释放,从而吸引活性淋巴细胞,激活补体系统.铝佐剂是目前应用最为广泛的一类佐剂,已批准的含铝佐剂疫苗涉及DTP、无细胞百日咳疫苗DTP(DTaP)、b型流感杆菌(HIB)疫苗(不是所有的)、乙型肝炎(HB)疫苗,以及所有的DTaP、HIB或HB的联合疫苗.还涉及甲型肝炎疫苗、莱姆病疫苗、炭疽疫苗和狂犬病疫苗.铝佐剂的缺陷是它不能诱导产生Th1型反映,干扰细胞免疫,并阻断CD8+CTL的激活,使得疫苗的免疫保护不全面,不持久,并且也有一些毒副作用.尽管不断的有报告认为铝佐剂由于其自身的缺陷也许会引起局部的不良反映.但由于铝佐剂的应用已有具有几十年的历史,就安全性而言相对于其它的新型佐剂还是较为安全可靠的.2.2油乳佐剂油乳佐剂中具有油和乳化剂,它的作用机制是抗原包被在油相形成的微结构内,使之形成贮存库而缓慢释放,刺激机体免疫细胞产生抗体。油乳佐剂重要有弗氏佐剂、佐剂-65、白油Span佐剂、MF-59等。弗氏佐剂(Freundadjuvant,FA)分为弗氏完全佐剂(Freundcompleteadjuvant,FCA)和弗氏不完全佐剂(Freundincompleteadjuvant,FIA)两种。FIA是由低黏度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂;FCA是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。FCA是细胞免疫的强刺激剂,而FIA则仅能刺激体液免疫。FCA和FIA重要局限性之处:可引起局部肉芽肿和无菌性脓肿;使用矿物油佐剂的小鼠曾发生肿瘤,因此也许有致癌问题;稳定性差,难以长期保存;有对结核菌素致敏等毒副作用,故仅限用于兽用。佐剂-65在体内可被代谢或分泌,用于人的流感疫苗安全有效,但较弗氏佐剂效果稍差。白油Span佐剂是用轻质矿物油作油相,用Span-80或Span-85及Tween-80作为乳化剂制成的油乳佐剂,是当前兽医生物制品中最常用、最有效的佐剂之一。MF-59为水包角沙鲨烯乳剂配方,由角鲨烯、Tween-80、Span-85等组成,已广泛用作于各种亚单位疫苗佐剂,可增强体液免疫应答和细胞免疫应答,副反映轻微。油乳剂刺激局部产生肉芽肿或炎症反映,吸引巨噬细胞等聚集,这些细胞产生大量活性物质,这些活性物质又增强了体液免疫和细胞免疫。2.3脂质体脂质体是一类以提高抗原输送和递呈为重要作用的佐剂。脂质体由磷脂和固醇类组成的含双层脂质分子的脂质球，其表面为疏水性结构，而内部为亲水性结构。其重要优点是脂质体膜对细胞膜具有很好的亲和性，容易将包被在脂质体上或内部的抗原(或编码抗原的DNA)成分输入到细胞内。目前可以根据规定制备直径不同的脂质球，也可以根据抗原分子的理化特性将抗原分子包被在脂质体的不同部位，如将含疏水性氨基酸较多的抗原插入脂双层中，而将含亲水性基团较多的抗原包裹在脂质球的中间区。脂质体疫苗可经黏膜免疫。脂质体膜与细胞膜的亲和性，非常有助于将包被的抗原递呈给抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells，APC)，并使抗原被溶酶体所降解，进而通过MHCⅠ和MHCⅡ途径递呈给免疫系统，同时激发细胞和体液免疫应答反映。脂质体在制备过程中规定一定的技术性，其费用也较其他免疫佐剂高，目前对脂质体的应用研究还重要集中在医学研究方面，在兽医疫苗研究上的应用前景还具有一定的不拟定因素。2.4微生物来源佐剂CpGDNACpGDNA是指一类序列中大部分以非甲基化胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元的寡聚体。可激活T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫效应细胞，又称为免疫刺激DNA序列(ISS)。CpGDNA重要存在于细菌源性的DNA中，能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6，从而诱导IgM的分泌，也可激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，分泌多种细胞因子(如IL-12、IFN和TNF)，间接促进CTL和NK细胞的活性，从而诱导对细胞内病原体产生细胞免疫。CpGDNA能增强机体的特异性和非特异性免疫效应。CpGDNA序列作为免疫佐剂有如下特点：①与常用的氢氧化铝佐剂具有协同作用，CpGDNA可以纠正氢氧化铝诱导Th2类型应答的缺陷。②一些不能与铝混合的减毒活疫苗或多价疫苗则可单独使用CpGDNA以增强其免疫原性。③应用范围广：CpGDNA作为疫苗佐剂，能增强鸡蛋溶菌酶、卵白蛋白、肿瘤抗原、乙肝疫苗和流感疫苗等抗原的免疫效果，能加强不同DNA疫苗的免疫反映。CpGDNA的免疫佐剂作用在小鼠和灵长类中均已得到证实。据报道，目前CpGDNA作为人乙肝疫苗佐剂已进入临床实验。虽然CpGDNA具有安全、有效的优点，但还是有许多问题有待解决，如它的免疫激活机制、免疫剂量（实验表白，高剂量CpGDNA及反复给药也许导致毒性效应）和最适免疫途径还需要进一步研究。2.5免疫刺激复合物

免疫刺激复合物(ISCOM)是一种有较高免疫活性的脂质小体,由极性抗原、植物皂甙(QuilA)和胆固醇按1∶1∶1的比例混合而成。它通过表面疏水作用将极性抗原分子和脂质分子交联成直径约为35nm的微粒,呈笼状结构,类似膜表面抗原构型。这种结构既固化了抗原,又模拟了体内辨认抗原的微环境,从而增强抗原的黏附性和机体的吞噬作用,有助于和抗原递呈细胞(APC)膜互相作用,诱导辅助性T细胞的克隆和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。ISCOM对细胞免疫和体液免疫都有增强作用,能诱导产生高效价抗体,且出现时间早,连续时间长,诱导的特异性抗体多为IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3;提高MHCⅠ分子在APC中的表达,诱导产生IL221、IL222及IFN2γ。除了增强细胞免疫和体液免疫作用外,ISCOM还具有黏膜免疫活性增强作用。存放和动物实验结果表白ISCOMs的稳定性和免疫原性均优于铝佐剂疫苗。2.6细胞因子佐剂细胞因子是具有重要生物学活性的细胞调节蛋白，它涉及淋巴因子和单核因子。细胞因子在许多动物模型系统中都是有效的免疫佐剂，能增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭，对肿瘤免疫和临床应用也有增效作用。虽然大多数情况下细胞因子没有FCA和皂苷有效，但它可用于人体，佐剂效率也有望得到改善。细胞因子作为免疫佐剂的研究重要集中在白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及转移生长因子(TCF)。免疫缺陷是由于某些细胞因子减少而引起的，因此，细胞因子用于增强免疫缺陷者的免疫能力有特别重要的意义。2.7纳米粒子佐剂纳米粒子是指直径一般在10～1000nm之间的聚合物形成的微粒,它具有独特的小尺寸效应和界面效应.抗原物质或能编码免疫原多肽的DNA或RNA可被包裹于纳米粒子内部或是吸附在纳米粒子表面,也可通过化学连接作用与纳米粒子结合,纳米粒子佐剂可有效提高细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。2.8天然来源佐剂蜂胶具有广谱的生物学活性，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫机制和丙种球蛋白活性，增长抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。用蜂胶制成的禽霍乱菌苗，具有安全可靠、保护率高（95.5%）、免疫期长（6个月）、产生坚强免疫力的时间早（注射后第5天）和无毒副作用等优点。蜂胶所含的成分极其复杂。研究表白，蜂胶自身无明显抗原性和过敏性，毒副作用较小。天然来源佐剂尚有多糖香菇多糖、云芝多糖、黄芪多糖、芦荟多糖、淫羊藿等。3存在的问题和展望

3.1存在的问题及安全性

当前使用的各类佐剂，尚有许多不够抱负之处，如某些佐剂接种引起局部炎症、罕见的肉芽肿或无菌性脓肿。在实验动物中观测到的对佐剂的全身反映涉及不适、发热、佐剂性关节炎等。这些不良反映也许由佐剂与抗原自身的互相作用而引起，也也许由佐剂引起的对特定抗原的应答类型所致。因此，必须对佐剂进行更加进一步的了解，阐明其免疫效应机理，合理运用，尽量使佐剂的应用安全高效。

3.2展望

开发研制新型的免疫佐剂以增强疫苗的免疫效力并减少疫苗的毒副作用将是未来的发展趋势，新型疫苗佐剂是研究其免疫性与毒性的最佳平衡。它是生物反映调节剂中免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是发挥其免疫佐剂性，使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件。

随着研究的进一步，此后对免疫佐剂的研究则重要集中在以下几个方面：①进一步开展对免疫佐剂构效关系及其活性分子结构改造的研究，研制出化学结构明确、分子质量低、低毒、高效的新型免疫佐剂。②在整体水平、细胞水平及分子水平上，探讨新型免疫佐剂的作用机制，为进一步安全、有效、合理地使用免疫佐剂提供理论依据。③开展抗原-载体-免疫佐剂的药剂学研究，涉及优化免疫佐剂配方的研究，为制备低毒、高效、速效、长效的新免疫佐剂制剂开辟新途径；④开展诱导黏膜免疫的口服佐剂的研究。⑤天然药物免疫佐剂的开发研究。⑥免疫佐剂新用途研究。免疫佐剂的应用范围不断扩大，涉及了免疫治疗药物、肿瘤疫苗，增强机体对细菌、病毒、真菌、寄生虫及一些转移瘤的抵抗力和免疫应答。⑦开展宿主内源性免疫调节剂用作免疫佐剂及其诱生剂的研究，特别是T细胞对抗原辨认的分子基础和控制T细胞活化和功能专职应答的研究进展，使免疫佐剂的作用不再局限于增强免疫应答，而更着重于诱导机体选择性地产生有效防御相应病原体感染的特异性免疫应答，减少抗原的副作用。现在，由于高度纯化的新型疫苗的生产技术不断取得突破，而常规佐剂由于其自身的缺陷很难适应新型疫苗的开发，所以新佐剂的研究已经逐渐引起科研工作者的注意。随着科技的进步，研究的不断进一步，相信上述诸多问题将逐个被解决，将有更多的佐剂用于疫苗制造，佐剂的有效应用会在人类和动物疾病的防止过程中，发挥更大的作用。参考文献：[1]DotsikaE,KaragouniE,SundquistB,etal.InfluenceofQuillajasaponariatriterpenoidcontentontheimmunomodulatorycapacityofEpstein-BarrvirusISCOMs[J].ScandJImmunol,1997,45:261-268.[2]李忠明.当代新疫苗[M].北京:高等教育出版社,2023:79-103.[3]VegelFRimprovingvaccineperformancewithadjuvants[J].ClinInfectDis,2023,30(13):266

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而通过基因组提供的潜在抗原信息，将这些初期蛋白作为抗原显示了很好的结果。3.2.2乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的外膜蛋白(S)携带有B和T淋巴细胞表位,能刺激机体产生保护性免疫应答反映,是引起宿主产生保护性应答反映的免疫学表位。通过基因工程手段获得这一免疫原性蛋白,进而可研制成基因工程疫苗。目前重组乙型肝炎疫苗(HBV)已成功应用于乙型肝炎病毒感染,也是迄今应用最成功、最广泛的基因工程疫苗。3.3反向疫苗学在寄生虫疫苗研发中的应用 疟疾（malaria）是通过蚊叮咬传播的寄生虫病，其病原体为疟原虫。疟原虫在不同的生活周期中表达不同抗原，使疫苗的研制非常困难。尽管已从疟原虫中鉴定出20多种抗原，但没有一种适合做疫苗。应用反向疫苗学有望获得突破。从全基因组序列预测了6000个基因信息，以重组蛋白形式表达或以DNA疫苗形式表达，基因表达产物具有免疫原性。相信最终会研制出有效的疫苗防治疟疾。4展望20世纪90年代末是基因组时代开始的标志,基因组测序和分析正处在飞速发展的时期。越来越多的病原微生物完毕了基因组序列的测定,为研究新型的有效疫苗和攻克各种感染性疾病开辟了道路。反向疫苗学的特点是大规模、高通量、自动化,可在短期内完毕大量候选疫苗抗原的筛选和鉴定,并且还可发现具有保护性免疫反映的新抗原。因此,人们都寄希望于用它来解决传统疫苗学长期不能解决的某些重要传染病的疫苗防止问题。但是反向疫苗学作为传统疫苗学的发展，自身还存在着一些局限性之处。一方面，基因组学可以预测大部分阅读框，但却不能预测所有的阅读框，并且预测基因的起始密码子也并非没有缺陷，同时预测表面或分泌性蛋白的各种算法自身也存在局限性之处。另一方面，一些阅读框在实际自然感染中表达的蛋白，与在实验室培养的细菌感染中表达的蛋白有明显差别，因此，出现抗血清与重组蛋白有强烈反映，但是与实验室培养细菌没有反映这种情况也局限性为奇。最后，反向疫苗学方法目前只能应用于蛋白质抗原，不能鉴别非蛋白质抗原，如多糖、糖脂等。尽管反向疫苗学存在着局限性和困难，但是在疫苗发展的道路上，仍起巨大的推动作用。在目前的研究中，已经运用这种方法从大量抗原中筛选出了一些候选疫苗，填补了传统疫苗学的局限性，此后也越来越成为疫苗开发中的重要手段,对疫苗的研制生产将会起到越来越重要的作用。 参考文献：[1]RappuoliR.Reversevaccinology[J].CurropinMicrobiol2023,3:445-450.[2]RappuoliR.Reversevaccinology,agenome-basedapproachtovaccinedevelopment[J].Vaccine2023,19:2688-2691.[3]Wizemann TM,Heinrichs JH,Adamou JE,et al.Use of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against streptococcus pneumoniae infection[J].Infect Immun,2023,69(3):1593-1598.[4]MoraM，VeggiD，SantiniL，etal．Reversevaccinology［J］．DrugDiscoverToday，2023，10(8):459-464．[5]XiangZS，HeYQ．Vaxign:aweb-basedvaccinetar