医学交流课件：单克隆抗体技术

单克隆抗体技术可用抗体治疗的疾病移植排斥肿瘤自身免疫病心血管疾病感染性疾病过敏性疾病治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清（二）治疗用抗体部分

1975年8月7日，Kohler和Milstein在Nature上发表了一篇报道,题为Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.(Nature1975;256:495)“可分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养。”这一文献已成为一篇经典的文献,对生物学和医学领域中的基础和应用研究有着深远的意义。为此,Kohler和Milstein获得了1984年诺贝尔医学生理学奖。这一技术上的突破,在制造和使用抗体方面开创了一个新纪元。所以Mab被称为第二代抗体。治疗性抗体(TherapeuticalMonoclonalAntibodies)26种Bevacizumab(anti-EGFR)转移性结肠直肠癌Efalizumab(anti-CDIIa)慢性中、重度银屑病I-131Tositumomab(anti-CD20)non-Hodgkin淋巴瘤Abciximab(anti-GPIIb/IIIa)抗凝Alemtuzumab(anti-CD52)B-细胞慢性淋巴细胞白血病Infliximab(anti-TNFα)Crohn’s病，类风湿性关节炎Trastuzumab(antiHER-2)转移性乳腺癌Basiliximab(anti-CD25)肾移植急性排斥Cetuximab(anti-EGFR)转移性结肠癌或直肠癌Rituximab(anti-CD20)non-Hodgkin’s淋巴瘤Muromomab-CD3(anti-CD3)肾移植急性排斥Daclizumab(anti-CD25)肾移植急性排斥Cetuximab单抗结肠癌Tysabri重组人源化IgG4k抗炎症反应产品适应症产品适应症Palivezumab(anti-FproteinofRSV)防治小儿下呼吸道合胞病毒感染Ibritumomabtiuxetan(anti-CD20)non-Hodgkin’s淋巴瘤Adalimumab(anti-TNFα/anti-CD33)CD33急性髓性白血病Omalizumab(anti-IgE)中、重度持续性哮喘Campath人源化抗体抗CD52Rituxan嵌合抗体抗CD20Mylotarg(抗生素标记重组人IgG4)抗CD33Humira重组全人IgG1抗TNFSynagis人源化IgG1抗RSV病毒表位F蛋白Remicade嵌合IgG1抗TNFaBexxarI131标记鼠IgG2a抗CD20(超敏反应)淋巴细胞T淋巴因子（干扰素）细胞免疫B抗体体液免疫一、抗体的结构和功能

1、一个抗体分子包括两个完全相同的重链分子（H）和两个完全相同的轻链分子（L）

2、用木瓜蛋白酶处理可将抗体分解为3个部分，即两个Fab片段和个Fc片段：

Fab：保存与抗原结合的活性和特异性

Fc：抗体结合抗原后激活机体免疫反应的主要部位VLCLCHVH

FabFcBasicStructureofAbMolecules

抗体分子的基本结构重链由约450个氨基酸（IgG、IgA、IgD）或570个氨基酸（IgM、IgE）组成，轻链由约214个氨基酸组成。完整抗体的相对分子质量约为150kDa。在Ig分子氨基端，L链的1/2区段与H链的1/4区段的氨基酸组成及排列顺序多变，称为可变区（variableregion,V区）；羧基端L链的1/2区段与H链的3/4区段的氨基酸组成和排列比较恒定，称为恒定区（constantregion,C区）。在V区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区（complementarydeterminingregion,CDR），它是V区中特异结合抗原的部位。而C区则决定了Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。重链和轻链V区中各有3对CDR（CDRl，CDR2，CDR3），每个CDR长约5个~16个氨基酸。V区中CDR以外的部分称为框架区（frameworkregion,FR），FR区为β片层（β-sheet）结构，氨基酸组成相对保守，不与抗原分子直接结合，但对维持CDR的空间构型起着极为重要的作用。L链有VL和CL两个功能区，H链有VH和CH1、CH2、CH3等4个功能区。VL和VHCDR区共同构成一个抗原结合部位。哺乳类的轻链有两种型别，κ型和λ型。重链可分为μ、ε、γ、δ、α5类。多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。一,单克隆抗体定义

由最初一个细胞元件繁殖而形成的纯细胞集团，称一个克隆（clone）。单克隆是指由一个细胞经无性繁殖而形成的遗传性状完全相同的细胞群。把能分泌某种特异抗体的一个B淋巴细胞分离出来，通过纯种培养所产生的抗体只有一种。这种由单一克隆B淋巴细胞杂交瘤产生的，识别抗原分子上某一特定抗原决定簇的抗体，称单克隆抗体（McAb），简称单抗。McAb的主要特点:1.

高度均质性.2.

高度特异性—针对一个抗原决定簇.3.

来源稳定,可大批生产.二、单克隆抗体的制备1975年,英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein首先应用绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与多发性骨髓瘤细胞株(P3X63-Ag8)混合,加入仙台病毒,进行融合后,在选择性培养基HAT[H,Hypoxanthin次黄嘌呤;A,Aminopterin氨基喋呤,T,Thymidine胸腺密啶核苷]上克隆再克隆,得到单株无性繁殖杂交瘤细胞系。在基培养液的上清中或接种到小鼠腹腔的腹水中,含有高度专一的，能在单个抗原中决定簇水平上选择Ag的特异性抗体.这种Ab系由单株系细胞所产生,因此称为MAb。利用杂交瘤细胞系生产单克隆抗体1、抗原免疫

动物选择：Balb/c小鼠抗原途径2、细胞融合

骨髓瘤细胞：HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型）

脾细胞

病毒

聚乙二醇（PEG）

电融合技术

PEG的作用机制PEG可以使细胞聚积在一起,当PEG的浓度达50%时,PEG可能与邻近膜的水分相结合,使细胞之间只有几个埃的空间的水分被取代,由此,降低细胞表面的极性,导致脂双层不稳定,引起细胞膜的融合.3、杂交瘤细胞的选择HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶）核酸合成途径：全合成途径（被叶酸拮抗剂氨基蝶呤阻断）补救途径（关键酶为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT）核苷酸的合成(从无到有)甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸THFA5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸THFA5-甲酰胺-4-氨甲酰咪唑核苷酸补救途径次黄嘌呤次黄嘌呤-5磷酸次黄嘌呤磷酸核糖转移酶4、克隆化与再克隆化克隆：由单个细胞繁殖扩增而形成性状均一的细胞集落的过程（1），有限稀释技术柏松分布（2），半固体琼脂培养法0.5%琼脂培养基中进行克隆三,单克隆抗体的检测1、单克隆抗体活性检测

原理：酶联免疫吸附实验（ELISA）

2、杂交瘤染色体分析

3、Ig亚类分析鉴定①

先分析Ig类型,IgG,A,M②

再分析亚类,IgG1,IgG2a,IgG2b4、单克隆抗体纯度鉴定

1.包被已知抗原:Ag要纯,Ag越纯，特异性越高。蛋白浓度1-10ug/ml.

每孔加0.2mL,4℃过夜.PBST洗3次x5’;封闭10%小牛血清.37℃30’.PBST洗3x5’。加培养上清37℃2h.PBST洗3x5’。注意加阳性对照，阴性对照。4.加酶标记二抗(兔抗鼠)37℃2hPBST洗3x5’。

5.加底物显色.6.加终止剂2MH2SO4,50uL测OD值判定结果:

阴性孔应无色或接近无色.

阳性孔明显显色.OPD-棕红色测定孔OD≥2倍以上,判定为阳性四,杂交瘤细胞的冻存与复苏

五,杂交瘤单抗的大量制备①.

动物腹水制备②.

细胞悬浮培养六,McAb的纯化

盐析

DEAE凝胶过滤亲和层析(proteinA)七,单克隆抗体应用

1、单克隆抗体靶向制剂

1）药物与单抗直接偶联

2）药物通过小分子与单抗连接

3）药物通过大分子与单抗相连

2、肿瘤的导向治疗类别分类品名类别分类品名毒素类植物毒素蓖麻毒素、肥皂草素、厥连毒素烷化剂苯丁酸氮芥，美法仑，动物毒素海葵溶血毒素抗有丝分裂剂长春硷类，阿霉素，4-去甲基柔红霉素微生物毒素绿脓杆菌外毒素、白喉毒素DNA嵌入剂美登素，Calicheamycin真菌毒素蛾膏覃硷、Ristricfocin酶类羧基肽酶G胞核戊苷脱氨基酶，减性磷酸酶放射性同位素α-放射性同位素212铋β-内酰胺酶β-放射性同位素204铊，32磷细胞因子白细胞介素II，肿瘤坏死因子，干扰素γ-放射性同位素127碘，99m锝，111铟脂质体化疗药物抗代谢剂氨甲喋呤，5-氟去氧尿嘧啶3,单克隆抗体与新型诊断技术体内微量成分和药物的测定癌症诊断传染病诊断蛇毒诊断体内定位诊断

放射免疫显影技术：是对肿瘤及其转移灶或复发灶进行定位或定性诊断的无创伤新技术

研究进展:1.基因工程抗体2.人/鼠杂交单克隆抗体3.噬菌体抗体

鼠抗体可变区人抗体恒定区人－鼠嵌合抗体人抗体可变区重构抗体(或改形抗体）(CDR移植的人单抗)人源化单抗制备细胞工程技术基因工程转基因动物和植物一,细胞技术EBV病毒转化人B细胞技术B细胞杂交瘤细胞技术EBV病毒转化杂交瘤细胞技术二,基因工程A,重组DNA嵌合抗体

用编码人抗体Fc区域的DNA片段替换编码鼠源单抗Fc的DNA片段，重组的DNA分子克隆到表达载体后转入培养的杂交瘤细胞，从该细胞收集的即为嵌合抗体

目前，用于治疗目的的单克隆抗体多为鼠源性单克隆抗体。鼠抗体基因与人基因的同源性较少，因此鼠源性单克隆抗体对人体具有较强的免疫原性，使用后很可能会诱发人抗鼠抗体反应。由于这种抗体反应90％是针对C区的，因此设计用人C区替代鼠C区，则可能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。

嵌合抗体的基本原理是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达,制备特异性嵌合抗体。嵌合抗体原理

根据抗体基因由多个不同功能区组成，每个功能区都位于独立外显子中的特点，人们可以对抗体基因进行重新组装。1984年由Morrison等构建的嵌合抗体（chimericanantibody)即是第一种基因工程抗体，开创了抗体工程的先例。B、改型抗体

为了减少鼠蛋白在嵌合抗体中所占的比例,在超变区进行氨基酸置换.通过置换鼠抗体超变区(CDR3)获得改型抗体或人源化抗体。

一种人源单克隆抗体的结构C.单链抗体

应用PCR技术得到抗体重链可变区VH,插入表达载体表达VH单区小抗体,与抗原有1/10的亲和力.将VL基因末端与VH基因N末端连接,将此重组基因转入E.Coli,所得的可变区单链抗体有原抗体与Ag结合的相同特异性和亲和力.最大的优点是分子小,可进入微循环,有利于实体瘤治疗诊断.三、双特异性抗体:

这种新型抗体的两个Fab片段能同时与不同的两个抗原结合即具有不同结合活性.

制备双特异抗体有化学偶联法.杂交瘤方法和基因工程方法.①.偶联法可快速、大量制备双特异抗体,但在体内易被清除.②.杂交瘤方法制备的双特异抗体生物活性高,但制备要经过融合,筛选而繁琐的步骤,耗时长,不易与其他单抗分离开.③.基因工程方法制备的双特异抗体分子量小,易于大量制备,有广阔前途.四、抗体库技术和噬菌体抗体

整套抗体(RepertoireAb.)McAb——基核细胞生产系统

1990年Mccafferty等证明:将Ab可变区基因插入噬菌体geneⅢ中,表达出与噬菌体衣壳蛋白的N末端相连的抗体—噬菌体融合蛋白.抗体功能片段呈现在噬菌体表面,而且能正确折叠,并能与特异性Ag结合,由于有此特性,可用抗原直接筛选基因文库中任何一种所需要的抗体,使得整套抗体的分离.生产更快更容易.从分离的淋巴细胞中提取mRNAmRNA逆转录为cDNA通过PCR扩增重链和轻链用一套特别的限制性内切酶酶解将重链序列克隆到重链丝状噬菌体载体中将重链和轻链重组到一个丝状噬菌体载体中用抗原结合筛选噬菌斑将轻链序列克隆到轻链丝状噬菌体载体中在丝状噬菌体中表达抗体的过程噬菌体抗体的生产分四个步骤1.

从免疫或未免疫的B细胞中分离Ab可变区基因.2.

PCR扩增抗体基因片段并克隆进噬菌体以建立基因文库(可达106-109).3.克隆到入噬菌体,建立基因文库.筛选特异性的

VH,VLDNA片段.4.测定序列.将此完整的小鼠VH,VL基因分别与人的CL,CH相嵌合,构成嵌合基因.5.转染骨髓瘤细胞.表达Ig分子.

也可用反转录PCR技术构建小鼠V区CDNA文库.五转基因鼠1,在鼠胚胎干细胞内（ＥＳ）采用内源技术使鼠IgH和IgK基因失活２,相互繁育和回交产生ＤＩ鼠不能产生鼠源抗体，３，以人工酵母染色体转移系统将含有人的IgH（ＹＨ２）和IgK（ＹＫ２）的基因整合到ＥＳ细胞染色体上生成转基因小鼠八,转基因植物重组人α干扰素

单克隆抗体的研制

干扰素是细胞免疫的重要成分，目前广泛应用于病毒性肝炎、肿瘤和一些其他病毒感染的治疗中。干扰素的检测和重组人干扰素的纯化工艺均需要高质量的单克隆抗体，特别是在生产重组干扰素工艺中，单克隆抗体亲和层析是生产干扰素最重要步骤。1、杂交瘤细胞株的建立纯化重组人干扰素α1ｂ（抗原）6周龄雄性BALB/c小鼠100μｇ抗原＋完全佛氏佐剂100μｇ抗原＋不完全佛氏佐剂100μｇ抗原＋不完全佛氏佐剂尾静脉注射抗原100μｇ第一次免疫第二次免疫第三次免疫加强免疫↓↓↓↓1个月后2个月后融合前3天动物免疫无菌取脾细胞小鼠骨髓瘤细胞SP2/01:5~1:10混合，离心＋37℃水浴，加入预温的50%PEG，静置1.5min，滴加不完全DMEM，离心加完全DMEM接种在96孔细胞培养板中，置37℃5%CO2环境培养第2天换含1%HAT完全DMEM培养基14d后换1%HT培养基，挑选克隆细胞融合ELISA方法检测抗体阳性克隆筛选细胞体外扩增腹腔接种BLAB/c小鼠14d后收集腹水腹水制备2、抗体的筛选

采用ELISA方法检测细胞上清液、腹水中和抗体滴度,分别用重组人干扰素(α1ｂ、α2ｂ、α2ａ、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素作抗原。3、抗体特异性鉴定交叉中和试验Westernblot试验4、免疫球蛋白类和亚类的鉴定5、杂交瘤细胞染色体核型分析6、单克隆抗体纯化7、单克隆抗体蛋白计算8、抗人α型干扰素亲和层析柱的制备动物细胞制药动物细胞制药

动物细胞特点无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化

动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。生产用动物细胞原代细胞二倍体细胞转化细胞基因工程细胞动物细胞的培养动物细胞培养的基本条件：严格灭菌不能有有害物质适量的供氧清除代谢废物，良好的生成环境及时分种生长形式悬浮培养半悬浮培养贴壁培养培养基的种类天然合成无血清体外培养特点营养条件苛刻适应性差,敏感培养时间长，易污染体外培养条件温度，37度pH：7.2-7.4气体，氧，二氧化碳，氮气营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供供应公司杂交瘤细胞CHO细胞昆虫细胞淋巴样细胞通用Bio-WhittakerIncUltradoma(30)Ultra-CHO(<300)InsectXpress(0)Ex-Vivorange(1000-2000)UltraCulture(3000)UltradomaPF(0)BoehringerMannheimNutridomarange(40-100)————GiboHybridomaSFM(730)CHO-SFM(400)SF900AIMV—HybridomaPHFM(0)HycloneLaboratorlesCCM-1(200)CCM-5(<400)CCM-3(0)——ICNFlowBiorich2—Biorich2——JRHBiosciencesSeralabEx-cell300(11)Ex-cell301(100)Ex-cel(401)Aprotain-1(0)—Ex-cell309(10)SigmaQBSF-52(45)—SFinsect——QBSF-55(65)Medium(0)TCSBiologicalsLtd.Softcell-domaLP(30)Softcell-CHO(300)Softcell-insect(0)—Softcell-Universal(3000)Softcell-domaHP(0)VentrexHL-1(<50)————当前从市场可获得的适用于各种细胞的无血清培养基成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)丙氨酸(L-alanine)8.9精氨酸(L-arginine)17.4200.0精氨酸(L-arginine·HCl)126.084.0211.0天冬酰胺(L-asparagine)50.0天冬酰胺(L-asparagine·H2O)15.0天冬氨酸(L-asparagineacid)13.320.0半胱氨酸(L-cystelne·HCl·H2O)35.12胱氨酸(L-cystine)12.048.050.0胱氨酸(L-cystine·HCl)31.0谷氨酸(L-glutamicacid)14.720.0谷氨酰胺(L-glutamine)292.0292.0584.0146.0300.0甘氨酸(glycine)30.07.510.0常用培养基成分及配方/mg·L-11常用培养基成分及配方/mg·L-12成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)组氨酸(L-histidine)8.015.0组氨酸(L-histidine·HCl·H2O)42.042.020.96羟脯氨酸(L-hydroxyproline)20.0异亮氨酸(L-isoleucine)26.052.0105.03.950.0亮氨酸(L-leucine)26.052.0105.013.150.0赖氨酸(L-lysine)29.2赖氨酸(L-lysine·HCl)72.5146.036.540.0甲硫氨酸(L-methionine)7.515.030.04.4815.0苯丙氨酸(L-phenylalanine)16.532.066.04.9615.0脯氨酸(L-proline)34.520.0丝氨酸(L-serine)42.010.530.0苏氨酸(L-threonine)色氨酸(L-tryptophan)酪氨酸(L-tyrosine)24.04.018.048.010.095.016.072.011.92.0420.05.020.0成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)酪氨酸(L-tyrosine2Na·2H2O)52.07.8缬氨酸(L-valine)23.546.094.011.720.0生物素(D-biotln)1.00.00730.2偏多酸钙(D-calciumpantothenate)1.01.04.00.480.25氯化胆碱(cholinechloride)1.01.04.013.963.0叶酸(folicacid)1.01.04.01.31.0肌醇(inositol)2.02.07.218.035.0烟酰胺(nicotinamide)1.01.04.00.0371.0吡哆醛(pyridoxal·HCl)1.01.04.00.0621.0核黄素(riboflavin)0.10.10.40.0380.2硫胺(thiamin·HCl)1.01.04.00.341.0维生素B2(vitamineB2)1.360.005对氨基苯甲酸(P-aminobenzoicacid)1.0常用培养基成分及配方/mg·L-13常用培养基成分及配方/mg·L-14成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)CaCl2200.0200.0200.033.22KCl400.0400.0400.0223.6400.0MgCl257.22MgSO497.67MgSO4·7H2O200.0200.0100.0NaCl6800.06800.06400.07599.06000.0NaHCO32200.02200.03700.07176.02000.0Na2HPO4·H2O140.0140.0125.0142.04CuSO4·5H2O0.0025FeSO4·7H2O0.100.834ZnSO4·7H2O0.863Ca(NO3)2·4H2O100.0常用培养基成分及配方/mg·L-15成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)葡萄糖(D-glucose)1000.01000.04500.01802.0200.0硫辛酸(lipoicacid)15.00.21酚红(phenolred)10.010.01.25.0丙酮酸钠(sodiumpyruvate)110.0次黄嘌呤(hypoxanthine)4.77亚油酸(linoleicacid)0.084腐胺(putrescine·2HCl)0.161胸腺嘧啶核苷(thymidine)0.73谷胱甘肽(glutathionereduced)1.0大规模培养技术悬浮贴壁微载体包埋和微束结团商品名基质带电基和交换当量形状直径大小/um比表面积/cm2·g-1比重/g·mL-1透明度Cytodex-1葡聚糖DEAE1.5meq/g球状131-21060001.03+Superbeads葡聚糖DEAE2.0meq/g球状135-2055000-6000ND+Biocarrier聚丙烯酰胺二甲胺苯基1.4meq/g球状120-18050001.04+Cytodex-2葡聚糖三甲基2羟胺基0.6meq/g球状114-19855001.04+Cytodex-3葡聚糖60ug胶原/cm2载体表面球状133-2154500ND+Ventragel交联明胶明胶球状150-250ND1.03+Celibeads交联明胶明胶球状115-2353300-43001.04+Btostlon聚苯乙烯负电荷球状160-3002251.05±Cytosperes聚苯乙烯负电荷球状160-3002501.04±DE-53纤维素DEAE2.0meq/g柱状40-50NDND-已商品化的微载体商品名基质直径/um比重/gm·L-1孔径/um空体积/%比表面积/cm2·g-1公司CultipherS明胶170-2701.0310-20501.5PercellCultipherGLD明胶加钛430-600ND50-100500.25PercellVX-100明胶加钛5001.6-1.720-40850.4VeraxInformatrix胶原-葡聚糖400-8001.00220-6099NDBiomatSiran玻璃300-500ND10-10060NDSchottGlaswerkeAsahiMC纤维素180-2101.0330982.8AsahiCytopore1纤维素200-2801.0330982.8PharmaciaCytopore2纤维素200-2801.0330982.8Pharmacia已商品化的多孔载体平床式中空纤维生物反应器示意图三室系统的Membroferm生物反应器示意图笼式通气搅拌器示意图气升式生物反应器示意图VitafiberⅡ型圆柱状中空纤维反应器示意图多极流化床CF-IMMO生物反应器示意图CelliGenplus生物反应器示意图Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒转基因技术

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。转基因动物

转基因动物（transgenicanimal）是把外源基因导入动物的生殖细胞中，并整合该外源基因的细胞能发育成为个体，整合的外源基因又能影响其后代遗传的动物。

转基因动物

TransgenicAnimals用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内,并能稳定传代的一类动物。 制造产品、改良生命、研究手段

转基因动物在全世界范围内形成一个高潮，在1998年世界上最保守的英国利用转基因动物的实验增加了27%，占整个动物实验量的17%。转基因动物产业化也迅猛发展，全球依赖转基因动物技术为核心的公司43家。近年来转基因动物的研究在促进生长，提高抗病力，血液肽生产和利用乳腺生物反应器来生产药用蛋白以及疾病模型等主要的方面取得了明显的进展。一、基本过程及原理供体的基因受体的受精卵高效表达;定位整合、稳定遗传和适度表达与建立转基因动物相关的技术生产转基因动物的关键技术包括：（1）外源目的基因的获得和组构（2）将外源目的基因有效地导人生殖细胞或胚胎干细胞，经选择获得转目的基因的细胞（3）选择合适的体外培养系统和宿主动物，使转基因胚胎发育（4）鉴定、筛选所得到的转基因动物品系基因转移、胚胎移植与建系

基因导入技术：物理、化学和生物学方法1)显微注射法（microinjection)2)胚胎干细胞法（embryonicstemcells,ES细胞）3)逆转录病毒感染法4)精子载体法

原核注射法是将外源基因（转基因或DNA的构建）的多个拷贝导入到受精卵的原核中。迄今为止利用这种方法已经生产了大量转基因动物。利用显微注射生产转基因牛和羊包括收集卵母细胞、卵母细胞的体外成熟、体外授精、显微注射后的体外胚胎培养和转移胚胎到接受者体中等一系列的操作。DNA显微注射精原核卵原核DNA注射针持卵管显微注射仪

显微注射法的特点快速操作较简单DNA大小无限制有效率3-5%随机整合总效率较低(实际成功率1/1000)

以小鼠转基因为例：

1.注射外源基因后受精卵的存活率为86％

2.将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存 活率为25％

3.母鼠的怀孕率为80％

4.转基因在基因组上的整合率为24％

5.因此小鼠转基因的总有效率约为4％动物转基因的效率胚胎干细胞法胚胎干细胞(embryonicstemcellES)是从早期胚胎细胞团分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多功能细胞．其是一种正常二倍体细胞，能参与胚胎的发育，因此可对ＥＳ细胞进行基因操作．

2)胚胎干细胞法

（embryonicstemcells,ES细胞）胚泡培养皿中培养分离内层细胞团胰蛋白酶解离加饲养层细胞培养胚胎干细胞2)胚胎干细胞法DNA胚胎干细胞磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法囊胚原肠胚微注射转基因动物筛选胚胎干细胞法的特点一般带有定点整合元件,避免了随机整合体外培养,正-负选择,相对较简单需经过多代才能得到纯合的转基因动物，成本高目前只在小鼠身上获得成功逆转录病毒感染法

1974年Jaenisch等用逆转录病毒作为转基因载体，将SV40DNA

注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内有SV40DNA整合。3)逆转录病毒感染法

逆转录病毒载体外源基因四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚逆转录病毒感染嵌合小鼠纯合转基因小鼠反转录病毒外源基因8细胞胚植入代孕母鼠嵌合小鼠纯合转基因小鼠杂交、筛选通过反转录病毒载体获得转基因小鼠逆转录病毒感染法的特点单位点单拷贝整合插入位点分析较容易对家禽类的转基因研究有重要意义反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)转入的基因易缺少其邻近的调控序列有可能大量复制病毒和存在病毒污染精子载体法该方法是将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带外源DNA进入卵中并受精，从而使外源DNA整合到染色体中。4)精子载体法DNA精子受精卵卵细胞共育法脂质体转染法电穿孔法转基因动物精子载体法特点简便、实用外源DNA以附加体存在,不再受宿主DNA的影响理论上有较好前景小鼠和鱼具体机制不清楚,尚待进一步改进体细胞核移植法该技术是以动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆，进而得到带有外源基因的转基因动物。DNA精子受精卵DNA卵细胞微注射DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射

基因的整合、表达检测与细胞筛选

1)

随机整合：线性化DNA分子, DNA的浓度和构型、缓冲液成分， 核内注射整合位点多变，影响表达 水平和组织特异性表达2) 共整合：将不同基因或不同构件同 时注射3) 同源重组/定位整合:

基因打靶

基因打靶

genetargeting基因敲除(geneknockout):

将某个基因定向去除基因敲入(geneknockin):

定向将一段基因序列替 代另一段基因序列通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物体内研究此基因的功能1.打靶载体的构建同源基因片段质粒载体neor基因HSV-tk基因

HB1 HB2同源重组整合,neo基因置换ES细胞基因组的目的基因tk1HB1neorHB2tk2非特异整合正负选择法:

neor:新霉素抗性基因,G418tk:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶,自杀基因,GCV特异整合tk1HB1neorHB2tk22.打靶载体导入ES细胞磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法脂质体包埋法显微注射法3.基因敲除ES细胞注射入胚泡

4.胚泡植入假孕小鼠的子宫中

5.嵌合体的杂交育种

4.转移注射卵

假孕母鼠：输卵管转移和子宫转移5.鉴定和鼠系建立胚鼠组织、胎鼠组织、幼鼠尾巴：外源基因的整合检测，确定转基因鼠幼鼠血液：表达水平检测鉴定方法PCRSouthernblot染色体原位杂交NorthernblotRT-PCRWesternblotPCR鉴定tk1HB1neorHB2tk2P1P2PCR无条带非特异整合P1PCR特异条带P2CSHB1neorHB2特异整合1.打靶载体的构建同源基因片段质粒载体neor基因HSV-tk基因

HB1 HB22.打靶载体导入ES细胞磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法脂质体包埋法显微注射法同源重组整合,neo基因置换ES细胞基因组的目的基因tk1HB1neorHB2tk2非特异整合正负选择法:

neor:新霉素抗性基因,G418tk:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶,自杀基因,GCV特异整合tk1HB1neorHB2tk23.基因敲除ES细胞注射入胚泡

4.胚泡植入假孕小鼠的子宫中

5.嵌合体的杂交育种

多次交配可得纯合转基因鼠系含转入基因[嵌合体(chimericmouse)]转基因鼠纯合鼠系的建立二、转基因动物的应用转基因大鼠、小鼠、羊、牛、兔、猪、鱼、昆虫分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能建立人类疾病的转基因动物模型基因产品的制备:乳腺、膀胱生物反应器动物新品种的培育与动物改良转基因动物制药的应用1998年全球转动物制药产品总销售额为6.2亿美元，预计到2010年总销量额将达到110亿美元，其中75亿美元是转基因动物产品，主要是药用蛋白和营养保健品。转基因动物制药转基因动物制药的优点：（1）利用的设备简单、不耗能、无环境污染；（2）品种多、产量高、质量好；（3）缩短生产周期短（目前新药的开发周期约需15-20年），利用转基因动物乳腺生物反应器，只需约5年）（4）生产成本低，用其他生产工艺（如哺乳动物细胞培养方法）来生产1g药物蛋白，成本需800-5000美元，而利用转基因动物只需要0.02-0.5美元1、利用转基因动物生产药用蛋白利用动物乳腺生物反应器生产人药用蛋白的美欧市场评估和R&D现状利用转基因动物生产人用营养保健（医疗）品现状

2、利用转基因动物生产人用营养保健（医疗）品

美国在21世纪初的营养医用品市场大约为2500亿美元，而欧洲将超过美国，目前全球营养医用品市场的平均增长率超过187%，其中营养医用蛋白的发展潜力最大，已经成为营养医用品的支柱，现在只满足市场需求的10~15%。欧美等国家在此领域开始了激烈的竞争，全球一些制药公司（如Jonhnson，Novartis，AmericanHomeProducts等）都纷纷对营养医用蛋白进行投资，而一些巨型制药公司（如GenzymeCorp，ZenecaGroupPLC等）则将一些营养