第十一章紫外可见分析法

1第十一章紫外－可见分光光度法药物分析教研室主要内容2第一节基本原理和概念第二节紫外可见分光光度计第三节紫外可见分光光度分析方法学习要求掌握紫外吸收光谱的电子跃迁类型、吸收带的类型及影响因素；Lambert-Beer定律及其物理意义、适用条件、偏离因素；UV-Vis法用于单组分定量的方法；熟悉紫外-可见分光光度计的主要部件、工作原理和光路类型；了解紫外-可见分光光度法定性及纯度检查方法。3概述4紫外-可见分光光度法：基于物质分子对紫外-可见光区（200-760nm）辐射的吸收的特性建立起来的一种定性、定量和结构分析的方法。特点：灵敏度可达10-4-10-6g/ml准确度0.2%-0.5%5

紫外可见光谱是由分子中价电子在不同的分子轨道之间跃迁产生的。一、电子跃迁类型第一节基本原理和概念饱和单键的电子不饱和双键的电子未成键的n电子（弧对电子）轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同6反键轨道成键轨道原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道以线性组合而生成两个分子轨道成键轨道：能量较低反键轨道：能量较高

orbital*orbital

orbital*orbital

n(p)electron跃迁类型：8分子轨道：按能量大小：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*93.电子跃迁类型（1）σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）

E很高，λ<150nm（远紫外区）（2）n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团(－OH，－NH2)E较大,λ150~250nm(真空紫外区)第一节基本原理和概念10（3）π→π*跃迁：不饱和基团(-C=C-，-C=O)E较小，λ~200nm

体系共轭，E更小，λ更大（4）n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）

E最小，λ200~400nm（近紫外区）按能量大小：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*第一节基本原理和概念

跃迁类型峰位强弱分子基团举例

*<150nm弱饱和烃类

CH3-CH3

(max=135nm)n*-200nm较强含-OH,-NH2CH3Cl-X,-S等(max=215nm=140)

*-200nm强含不饱和键CH2=CH2分子(max=165nm

=10-4)

n*200-400nm较弱含有杂原子CH3COCH3不饱和基团(max=279nm=10-30)电子跃迁类型12λmax<150200180-200200-400nmΕ

很高较大

>104

10_100按能量大小：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*→*n→*→*n→*CH3—CH3—NH2—OHC=CC=OC=SN=N△E跃迁类型实例C=O131.吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同，以吸光度A为纵坐标，波长λ为横坐标作图得到的曲线2.吸收光谱特征—定性依据

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→饱和σ-σ*跃迁产生强吸收不成峰二、相关的基本概念143.生色团（发色团）:能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键(π电子)和未成对电子(n电子)的基团，产生n→π*跃迁和π→π*跃迁例：

C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强二、相关的基本概念154．助色团：是指含有非键电子的杂原子饱和基团，可以使生色团吸收峰加强，同时使吸收峰长移的基团如：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2，—X5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）二、相关的基本概念16

6.增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应

减色效应：吸收强度减小的效应

7.强带和弱带：

εmax>104→强带

εmax<102→弱带二、相关的基本概念

吸收带：吸收峰在紫外-可见光谱中的位置

可分为：R带、K带、B带、E带、电荷转移吸收带、

配位体场吸收带171．R带：由n→π*跃迁产生含杂原子的不饱和基团:C＝O；C＝N；—N＝N—弱吸收，εmax<100;λmax250~400nm，溶剂极性增强，短移附近有强吸收峰时，R带长移或被掩盖。三、吸收带与分子结构的关系吸收带：吸收峰在紫外-可见光谱中的位置18三、吸收带与分子结构的关系2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生

(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—一般出现在较短波长区，210～250nm。②为强吸收，εmax>104③共轭双键增加，吸收峰长移，强度增加。193．B带：芳香族化合物的主要特征吸收带

苯λmax

～256nm，宽带，具有精细结构；εmax=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失三、吸收带与分子结构的关系204．E带：

芳香族化合物的特征吸收带

E1180nmεmax>104

（常观察不到）E2200nmεmax=7000

强吸收苯环被发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移），被助色团取代E2带λmax

和ε都变大三、吸收带与分子结构的关系211.位阻影响共轭效应，吸收带长移，吸光系数增加发色团在同一平面，易形成共轭位阻影响分子的平面性

λmax280nm(10500)λmax295.5nm(29000)顺式二苯乙烯反式二苯乙烯四、影响吸收带位置的因素22232.跨环效应有β、γ不饱和醛酮结构，适当的立体排列使R带长移，吸收强度增强

四、影响吸收带位置的因素243.溶剂效应（1）对λmax影响：

n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移

π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移

四、影响吸收带位置的因素（2）对吸收光谱精细结构影响

溶剂极性↑，苯环精细结构消失254.pH值的影响影响物质存在型体，影响吸收波长λmax210.5nm,270nmλmax235nm,287nmOH-H+-四、影响吸收带位置的因素：26五、朗伯-比尔定律透过率：T=It/I0，0<T<1吸光度：A=-lgT1、Lambert定律：A∝l（吸收层厚度）2、Beer定律：A∝C（吸收物质浓度）二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为：

A=Ecl27描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系五、朗伯-比尔定律A：吸光度E：吸光系数C：溶液浓度l：光路长度A=Ecl281、适用条件：

1)单色光2)稀溶液（10-2～10-5M）2、吸收度的加和性：a、b、c三种物质共存时3、该定律适用于固体、液体和气体样品公式讨论：294、吸光系数（E）：吸光物质在单位浓度及单位厚度时的

吸光度。根据浓度单位的不同，分为：（1）摩尔吸光系数ε在一定λ下，c=1mol/L，l=1cm时的吸光度（2）百分吸光系数在一定λ下，c=1g/100ml，l=1cm时的吸光度。（3）两者关系公式讨论：30吸光系数的讨论1、吸光系数不随浓度和光程长度的改变而改变，

仅与物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；2、（1）不同物质，对同一λ，ε一般不同；（ε↑，吸光能力↑）（2）同一物质，对不同λ，ε一般不同（εmax）31例：氯霉素（323.15），λmax=278nm，C=2.00mg/100mlT%=24.3%，l=，1cm,求：,ε32六、偏离Beer定律的因素（一）化学因素Lambert-Beer定律适用范围：稀溶液（＜10-2mol/L）溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶剂间的作用等原因,而发生偏离Beer定律的现象。六、偏离Beer定律的因素

亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱(a)

6.36×10-6mol/L

(b)

1.27×10-4mol/L(c)5.97×10-4mol/L（一）化学因素Lambert-Beer定律适用范围：稀溶液（＜10-2mol/L）溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶剂间的作用等原因,而发生偏离Beer定律的现象。对此可控制溶液浓度、pH等条件而设法减免。六、偏离Beer定律的因素36（二）光学因素a.非单色光

理论要求：平行单色光，实际：光源复合光

六、偏离Beer定律的因素照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度，这就使分离出来的光具一定的谱带宽度37b.杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值六、偏离Beer定律的因素（二）光学因素38c.反射光和散射光的影响：

反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光可使透射光减弱，A↑，一般可用空白对比校正消除d．非平行光的影响：使光程↑，l↑，A↑六、偏离Beer定律的因素（二）光学因素39（三）透光率的测量误差——ΔT六、偏离Beer定律的因素1）暗噪音：与检测器和放大电路等各部件的不确切性有关，与光讯号无关，可视为一个常量。其在A为0.2～0.7范围内，造成相对误差较小，为测量最适宜范围。

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讯号噪音亦称讯号散粒噪音。光敏元件受光照射时的电子迁移，每一单位时间中电子迁移数量是不相等的，而是在某一均值周围的随机数，形成测量光强时的不确定性。随机数变动的幅度随光照增强而增大，与光的波长及光敏元件的品质有关。

2）讯号噪音：与光讯号有关（三）透光率的测量误差——ΔT六、偏离Beer定律的因素41

第二节紫外-可见分光光度计4243一、基本组成光源单色器吸收池检测器显示器1.光源

钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~400nm2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件44

棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）464．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．讯号处理与显示器：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器47二、分光光度计的类型1．单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池→移动误差对光源要求高比色池配对(一)几种光路类型482．双光束分光光度计：

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱493．双波长分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差504．光多道二极管阵列检测分光光度计5152(二)光学性能1.波长范围：190-1100nm2.波长准确度：仪器显示波长与实际波长之差≤±0.3nm3.波长重现性：≤±0.2nm4.透光率范围：0-300%5.吸光度测量范围：-0.447～+3.006.光度准确度：≤±0.3%7.光度重复性：≤±0.3%8.分辨率：单色器分辨两条靠近的谱线的能力.260nm，△λ=0.3nm9.杂散光：220nm处（1%NaI）≤0.1%53(三)仪器的校正1.波长的校正氢灯或氘中的较强谱线486.13nm(F线)和656.28nm（C线）稀土玻璃（镨钕、钬）、某些元素（汞、钾、铯）苯蒸汽检查和校正波长读数。542.吸光度的校正60mg重铬酸钾用0.005mol/L的硫酸溶液稀释至1000ml，在规定波长处测定并计算吸收系数，与规定值比较。规定值：235nm123.0～126.0257nm142.8～146.2313nm47.0～50.3350nm105.5～108.53.吸收池校正

两吸收池测定的差值小于1%55一、定性分析二、定量分析定性鉴别纯度检查和杂质限量测定单组分的定量方法多组分的定量方法第三节紫外－可见分光光度分析方法三、结构分析56（一）单组分的定量方法

1．吸光系数法

2．标准曲线法

3．对照法：外标一点法注意:1）选择吸收光谱中的吸收峰对应的波长

2）多个吸收峰，选择无干扰的、较高的峰

3）测定波长大于溶剂的截止波长二、定量分析571．吸光系数法（绝对法）例：维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度?解：二、定量分析例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？

已知361nm处的百分吸光系数为207解：592．标准曲线法配制一系列浓度不同的标准溶液，在一定波长下分别测定吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c标准曲线。并从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。BlankStandardSampleSample二、定量分析60示例

芦丁含量测定