第六章 一般毒性2-2

毒性评价或安全性评价的基本目的受试物毒作用的表现和性质剂量－反应（效应）研究确定毒作用的靶器官确定损伤的可逆性其它：敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制、毒物动力学、中毒的解救措施…第四节短期、亚慢性和慢性毒性作用一、蓄积作用—检测方法概念蓄积作用（accumulation）：外来化合物进入机体之后，经代谢或原型排出体外，但当其连续、反复进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化合物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化合物的蓄积作用蓄积库（depot）：化学物蓄积的组织器官部位。常见的蓄积库包括：血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼概念物质蓄积（materialaccumulation）：用分析方法能测得机体内存在该化合物或其代谢产物，且随接触时间延长而增加功能(机能)蓄积(functionalaccumulation)

：在机体内虽不能被测出，却在长期接触下出现了慢性中毒现象蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒是论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据。目的

求外来化学物的蓄积系数了解蓄积毒性的强度为慢性及其它有关毒性试验提供剂量选择依据方法理化方法：应用化学分析或其他技术测定化学物进入机体后在体内含量变化的过程该方法可测定化学物的半衰期，故可作为检测物质蓄积的方法生物学方法：将多次染毒与一次染毒所产生的效应进行比较。所测蓄积性不能区分功能蓄积和物质蓄积研究方法

蓄积系数法

：在一定期限之内以低于致死剂量(<LD50)，每日给予实验动物，直至出现预计的毒性效应(或死亡)为止，计算达到预计效应的总累积剂量，求出累积剂量与一次接触该化合物产生相同效应的剂量的比值

.即为蓄积系数(K值)

√多用小鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)蓄积系数评价标准蓄积系数(K)蓄积作用分级<11~3~5~高度蓄积明显蓄积中等蓄积轻度蓄积某些外源化学物的慢性中毒效应无法用K值表示如多数有机磷化合物属于轻度蓄积（K>5），但小剂量反复与机体接触后，红细胞和脑组织的乙酰胆碱酯酶可以持续降低，且伴有神经系统症状方法：（1）急性毒性实验LD50(1)

（2）1/20-1/5LD50每日染毒

LD50(n)

（50%动物死亡时累计染毒的总量）（3）计算K值：K=LD50(n)/LD50(1)

若累计染毒量已达到5个LD50，动物仍未死亡或死亡未达到半数，可终止实验，其Ｋ值按＞５作为结果。1.固定剂量法方法：（1）测定LD50(1)（2）第1-4天，先给予0.1LD50(1)，以后每4天递增剂量1.5倍

LD50(n)（3）计算Ｋ值。

28天时死亡动物仍未达到半数，可停止实验，此时的总量达到12.8LD50(1)，即Ｋ＞12.8，可认为基本无蓄积。

２.递增剂量法方法：分为1/2、1/5、1/10、1/20LD50四个剂量组和对照组，每组10只动物，每天染毒一次，共染毒20天，观察每组动物死亡数量。结果判定：蓄积不明显：各剂量组均无死亡；弱蓄积性：仅1/2LD50组有死亡，其它剂量组无死亡；中等蓄积性：1/20LD50组无死亡，其它各组间死亡数有剂量反应关系；强蓄积性：1/20LD50组有死亡，且有剂量反应关系。

３.剂量固定的20天蓄积法研究方法

蓄积系数法

：在一定期限之内以低于致死剂量(<LD50)，每日给予实验动物，直至出现预计的毒性效应(或死亡)为止，计算达到预计效应的总累积剂量，求出累积剂量与一次接触该化合物产生相同效应的剂量的比值

.即为蓄积系数(K值)

√多用小鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)生物半减期法：利用动力学原理

生物半衰期法从上图可以看出，一种化学物质若以t1/2相等的时间间距染毒，其在体内经过6个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限的98.4%，此后即使继续接触该物质，机体的蓄积量基本上也不会增加。重复剂量毒性作用/亚急性毒性作用指实验动物或人连续接触外源化学物4周（28天）内所产生的毒效应。能初步确定相应的NOAEL/LOAEL我国毒理学评价标准中内容--食品、消毒剂、农药和新化学品二、短期毒性作用

三、亚慢和慢性毒性作用

外源化学物在长期重复染毒时可产生与急性毒性试验完全不同的毒作用随着动物的衰老，有些因素如组织易感性改变、代谢和生理功能的改变，以及自发性疾病等均可影响毒作用的性质和程度。某些重要的疾病例如心脏病、慢性肾衰、肿瘤等均与年龄增长有关。外源化学物的蓄积作用是发生慢性毒性作用的基础概念指实验动物或人连续较长时间接触外来化合物所出现的中毒效应。subchronictoxicity：实验动物或人连续较长期（约相当于生命周期1/10）接触外源化学物所产生的中毒效应。可基本确定NOAEL/LOAEL，啮齿类染毒90天，犬1年。chronictoxicity：实验动物或人长期接触外源化学物引起的毒性效应。啮齿类染毒至少12个月，亦可至终身。Parkinson等(1995)报告117种药品犬亚慢性(90天)和慢性(24月)毒性试验结果与大鼠(短期或长期毒性试验)的结果比较，几乎没有发现新的毒性资料，因此认为动物毒性试验长于6个月没有必要，除非研究致癌作用Weil等（1969）报告，112种受试物中，大鼠染毒90天后才出现毒性效应的只有3种，认为大鼠90天实验即可确定受试物的NOAEL慢性毒性试验倾向于和致癌试验合并进行试验目的观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用特点、靶器官；探索受试物作用机制；观察长期接触受试物所致毒性作用的可逆性；确定长期接触受试物所致毒作用的剂量－反应（效应）关系，确定其NOAEL和/或LOAEL，为制定人类接触的安全限量提供依据；观察不同动物对受试物的毒效应差异，为确定适当的安全系数，将结果外推到人提供依据。实验动物选择和要求-亚慢性试验

※两种实验动物：啮齿类（大鼠），非啮齿类（犬）

※实验时间较长：要求为断乳不久的动物，小鼠体重以15g、大鼠50-1０0g（<6周）左右为宜

※至少应设计３个染毒剂量组及１个正常对照组，必要时再加一个受试化合物的溶剂对照组

卫星组：试验中期解剖或试验结束后做恢复期观察，额外设置的动物组

※小动物每组不少于２0只，大动物每组不少于8只，分组要随机化。动物同性别个体初始体重相差应不超过平均体重的±20%。一般雌雄两性动物同时分别进行，各剂量组两性动物数相等

实验动物选择和要求-亚慢性试验

※尽可能使用高等级动物，在符合国家实验动物要求的试验环境中进行

※

预检（1周）：适应环境、筛检健康等不合要求的动物

※

给药前禁食处理：减少残留食物对毒物毒性的影响

※亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。低剂量组不宜出现任何看观察到的毒效应。

具体剂量的设计参考LD50和人体实际摄入量如以化学物LD50的1/201/5为最高剂量（或用人体拟用的最高剂量），高、中、低3个剂量间组距以2-4倍为递减。药品：大鼠—人临床拟用剂量的10、30、100倍非啮齿类：人临床拟用剂量的5、15、50食品：尽可能涵盖人体预期摄入量的100倍量（或动物最大给予剂量）染毒途径应考虑两点：（1）尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式；（2）应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。常为经口、经呼吸道和经皮肤三种受试物在饲料中的比例一般应小于5%，最大不超过10%。当掺入量超过5%时，要调整饲料的营养成分，使其比例尽量与对照组一致。一般为拟用临床用药期的2-3倍观察时间90天亚慢实验染毒期90天染毒+恢复期观察（28天）：观察受试物所致毒性的可逆性、持续性和迟发型试验期间至少应每天观察一次动物的一般表现、动物出现中毒表现的体征、程度、持续时间和死亡情况等。观察指标-亚慢性试验一般综合性观察指标：体重、食物利用率、中毒症状及出现各症状的先后次序、时间，脏器系数等一般化验指标：主要指血常规和肝、肾功能的检测病理学检查：确定靶部位、损伤的性质和程度食物利用率

动物每吃100g食物所增长的体重克数，表示为体重（g）/饲料（100g）。喂饲染毒时，可计算实际染毒剂量。食物利用率可以鉴别动物体重降低是由于进食减少，还是受试物毒作用。例如：大鼠喂饲溴甲烷熏蒸过的食物2个月，其体重平均增加156.6g，而对照组大鼠平均体重增加180.9g，虽然前者体重增加较慢，但接触组与对照组的食物利用率却基本相同（接触组为25.2，对照组为25.6），说明大鼠长期食用溴甲烷熏蒸过的食物，基本上不影响其对食物的吸收和利用，体重增长减慢可能是由于食欲下降或其它原因所致。系统尸检和组织病理学检查脏器称重和脏器系数（relativeorganweight）：又称脏器相对重量，指脏器湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占质量，表示为脏器质量(g)/体重(100g)。脏器适用于实质性脏器，包括：心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢等。脏器系数增大表示该脏器肿大，病变可能是增生、充血、水肿；脏器系数减小可能表示脏器发育不良或萎缩等变化。病理学检查：包括肉眼（大体）检查、病理切片检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构电镜检查等，分别从大体、组织、细胞、亚细胞甚至分子水平等多个方面发现受试物的毒效应。

特异性指标指可反映受试物对机体毒作用本质的特征性指标，常与毒作用机制有关，有时可作为效应生物学标志。双（3，5-二特丁基-4-羟基苄磷酸单乙酯）镍盐，结构可分成三个部分：

①二个分子的五价磷化合物，该部分有抗胆碱酯酶作用；

②2，6-二特丁基酚的结构，可诱导微粒体酶活性；

③作为一种有机镍或镍盐，可致皮炎及皮肤过敏。可逆性观察目的：了解毒性反应的可逆程度和可能出现的迟缓毒性末次给药后24小时，每组活杀部分动物，其余动物停止染毒，继续观察2～4周，检测各项指标，重点观察毒反应器官。指标观察时间一般状况和症状，每天观察一次。饲料消耗和体重，每周记录一次。试验周期小于3个月的，末次给药后24小时和恢复期结束时各进行一次全面检查。试验周期大于3个月的，可在试验中期活杀少量动物检测各项指标。濒死或死亡动物应即时检查。观察指标慢性毒性作用

chronictoxicity概念-慢性毒作用指实验动物或人长期（甚至终身）反复接触外来化合物所出现的毒效应时间:依受试物具体要求和动物种类定大鼠1年狗1-2年如果与致癌试验结合进行，染毒期限最好接近或等于动物的预期生命试验目的观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用特点、靶器官；阐明受试物慢性毒性的剂量－反应（效应）关系，确定其NOAEL和/或LOAEL，预测人群接触该受试物后可能发生慢性毒性的危险性，为制定人类接触的安全限量提供依据实验动物选择和要求-慢性试验

※两种实验动物：啮齿类，非啮齿类

※

要求为初断乳的动物，小鼠出生后3周，体重1012g；大鼠出生后34周，体重5070g

※一般雌雄两性动物同时分别进行，各剂量组两性动物数相等。

实验动物选择和要求-慢性

※至少应设计３个染毒剂量组及１个正常对照组，必要时再加一个受试化合物的溶剂对照组

，小动物每组40－60只，大动物每组８－12只，分组要随机化。如分批处死，试验结束时，每剂量组每性别的啮齿类动物不少于10只，非啮齿类动物不少于４只；动物同性别个体初始体重相差应不超过平均体重的20%。

※尽可能使用高等级动物，在符合国家实验动物要求的试验环境中进行

※剂量设置原则为：足够高的剂量以能观察到受试物的毒作用、阐明毒性靶器官同时试验能顺利进行；有明确的剂量－反应关系，得到理想的LOAEL和NOAEL。

参考：亚慢LOAEL、LD50剂量选择参考以亚慢性阈剂量或其1/5-1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/50-1/10为慢性毒性的预计阈剂量，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组以LD50为出发点，高、中、低三组分别为LD50的1/10、1/100、1/1000剂量间距一般为2-4倍（不超过10倍），以利于得到剂量-反应关系，也有利于排除实验动物个体敏感性差异一般来说，当预期受试物无明显毒性时，亚慢性和慢性毒性试验最高剂量(不进行体重和体表面积换算)设计为至少等于人拟用最大剂量的倍数是：保健食品应为100倍，中药为50倍，纯化学药品为30倍当以不同的剂量依据设计与较长期结果不一致时，需要根据以往的经验判断，或增加剂量组以保证得到良好的剂量-反应关系。试验期限-慢性12个月染毒期12个月染毒期+恢复期观察（28天）：观察受试物所致毒性的可逆性、持续性和迟发