实验一 蛋白质的定量测定

实验一蛋白质的定量测定

——Folin-酚试剂法(Lowry法)实验室规则一、学生必须服从老师的指导，按照实验目的、要求和方法做好充分准备，进行实验。二、保持实验室内安静、整洁，有秩序地进行工作。三、按照操作规程(规则)进行实验，正确地据实将实验数据等情况填写在规定的记录本上。四、节约实验材料和水电，按规定的数量取用原料和试剂。五、爱护仪器设备，实验完毕时，负责清洗干净，并按规定要求存放原处；仪器设备如有损坏，应立即报告老师，同时向管理人员说明情况，按规定办好报损或赔偿手续。六、实验室内严禁吸烟，不准带入食品，不准会客。七、不遵守实验室规则的应给予批评教育；对于严重违反操作规程并造成重大损失者，除赔偿损失外，并视情节轻重给予必要的纪律处分，直至追究法律责任。实验报告的书写实验报告是对实验结果的科学总结。书写实验报告是培养和提高文字表达能力及概括综合分析问题能力的重要训练方法。每次实验后要求写好实验报告。实验报告的书写要求结构完整、条理分明、文字简炼、书写工整、措词推理符合科学性、逻辑性。具体格式如下：1．实验名称姓名学号班级2．目的要求3.原理4.主要试剂和仪器5．操作方法：6．实验结果：是实验报告的重要部分，一般要列出经过归纳整理的结果，并将实验数据列表说明，若为图形资料，应做好标记及剪贴。7．讨论：要针对实验中所观察到的现象与结果而言，注意不要离开实验的实际去空谈理论或照抄书本。要判断结果是否为预期的，属于非预期的，要认真分析原因。1学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。2制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。一目的要求

二原理

、1.凯氏微量定氮法2.紫外分光光度法3.双缩脲法4.Folin—酚试剂法(Lowry法)微量凯氏定氮法

含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。此过程通常称为“消化”。强碱使硫酸铵分解游离出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液中和的程度，计算样品的含氮量。本法适用范围0.2-1.0mg氮，相对误差应小于2%。紫外分光光度法蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。紫外吸收法在蛋白质含量20-100µg/ml内服从比尔定律。双缩脲法

在碱性条件下,具有两个以上肽键的物质能与双缩脲试剂的铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），颜色深浅与肽键的多少即蛋白质含量成正比。

由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在。也可根据反应生成颜色的深浅，在540nm波长处进行比色，定量测定蛋白质的浓度。允许测定范围为1～10mg蛋白质。除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。2023/2/7BiochemistryExperiments12Folin—酚法(Lowry法)Step1碱性条件下蛋白质中的肽键与铜盐溶液作用生成铜－蛋白质络合物碱性条件下蛋白质中酪氨酸的酚基使磷钨酸—磷钼酸还原成兰色复合物显色反应，兰色。A500，540，660，700，750在一定条件下，兰色强度与蛋白质的量成正比例。Step2优缺点优点缺点操作简便灵敏度高费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差，干扰物质较多可检测的最低蛋白质量达5µg/ml，通常测定范围是25~250µg/ml试验结果的干扰因素干扰物质蔗糖Tris缓冲液硫酸胺酚类尿素柠檬酸胍硫酸钠三氯乙酸乙醇丙酮EDTAEGTATritonX-100dithiothreitol为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘制标准曲线。1器材[1]试管及试管架[2]移液管(5、1、0.5ml)、移液枪（0.2ml,用于样品蛋白质）[3]722型分光光度计[4]电热恒温水浴三试剂与器材2试剂[1]标准酪蛋白溶液：500μg／ml的标准酪蛋白溶液。[2]Fo1in—酚试剂甲[3]Fo1in—酚试剂乙[4]血清：稀释100倍。

Folin-甲由下述四种溶液配制(1)4％碳酸钠溶液；(2)0.2N氢氧化钠溶液；(3)1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液；(4)2％酒石酸钾钠溶液。在使用前，将(1)与(2)等体积混合配成碳酸钠—氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Fo1in—酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

Folin-乙在2000ml的磨口廻流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H20)100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H20)25g，蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。再加入硫酸锂(LiSO4)150g，蒸馏水50ml及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴。冷却后定容到1000ml，过滤，滤液呈绿色。反应物(ml)0（空白对照管）12345蛋白质标准溶液(500µg/ml)00.20.30.40.60.8蒸馏水ml1.00.80.70.60.40.2Folin-酚甲ml5.05.05.05.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.50.50.50.5A(640nm)蛋白质浓度(µg/ml)030456090120混匀后30度水浴锅中放置10min取6支试管

加Folin乙后立即摇匀，室温下放置30分钟后以0号试管为空白对照，在640nm处比色

四操作步骤1.标准曲线的制作制作标准曲线：以A640为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标标准蛋白浓度=标准液(mL)×标准液浓度（500μg/ml）/1.0

取2支试管，各加入一定量的血清稀释液(已经稀释100倍，其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取0.2ml血清稀释液，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到lml。其他操作与“标准曲线的制作”相同。

2.血清蛋白质浓度的测定反应物(ml)0（空白对照管）12血清稀释液(已经稀释100倍)00.20.2蒸馏水ml1.00.80.8Folin-酚甲ml5.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.5A(640nm)蛋白质浓度(mg/L)0混匀后30度水浴锅中放置10min取3支试管

加Folin乙后立即摇匀，30分钟后以0号试管为空白对照，在640nm处比色3、数据处理1、绘制标准曲线：以A500为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上或用EXCEL绘制标准曲线。2、计算特测蛋白浓度：用待测蛋白质的A500从标准曲线上查出其对应的蛋白含量，据实验中所加入的待测蛋白质的体积计算其浓度。10010100/(g)-6640＊＊＝血清稀释倍数数测定时用稀释血清的含量