GMP质量体系大肠杆菌检查法

目的：建立大肠杆菌检查法的标准操作程序，规范二大肠杆菌检查法的操作范围：适用于大肠杆菌检查法职责：检验科主管、检验员规程：1简述大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichiacoli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种，埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体，大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿，成人爆发性腹泻，为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。用4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠杆菌是一项新技术，其检验步聚为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG，Indole试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与Indole试验不一致时，则需分离培养，革兰染色，镜检及生化试验鉴别。原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明96%的大肠杆菌含β－葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG-靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99%。2仪器、设备及用具2.1无菌室［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.1.1］。2.2净化工作台.2.3恒温培养箱(36±1℃)2.4高压蒸汽灭菌器2.5 显微镜(1500×)2.6微波炉或其他适宜加热装置2.7水浴箱45±1℃2.8离心机(500～4000/min)2.9薄膜过滤装置微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45±0.02μm3.0电冰箱3.1匀浆仪3.2366nm紫外灯3.3玻璃器皿［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.2.2］3试液指示液3.10.9%无菌氯化钠溶液［附录3.1］3.2无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)［附录3.3］3.3无菌对氨基苯甲酸溶液［附录2.2］3.4无菌聚山梨酯80氯化钠溶液［附录3.2］3.5欧-波(Ehrlich-Boehme)试液［附录2.17］3.6甲基红试液［附录4.2］3.7V-P试液 ［附录2.11，2.13］3.8革兰染色液［附录2.4，2.10，2.16］3.9中性红指示液［附录4.1］3.10亚甲蓝指示液［附录4.3］3.11溴麝香草酚蓝指示液［附录4.6］3.12酸性品红指示液［附录4.7］3.13曙红钠指示液［附录4.9］4培养基4.1营养肉汤［附录5.1］4.2营养琼脂［附录5.2］4.3胆盐乳糖(BL)培养基［附录5.6］4.44-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基［附录5.7］4.5乳糖培养基，5%乳糖培养基［附录5.21，5.22］4.6蛋白胨水培养基［附录5.18］4.7磷酸盐葡萄胨水培养基［附录5.19］4.8枸橼酸盐培养基［附录5.20］4.9曙红亚甲蓝(EMB)琼脂［附录5.8］4.10麦康凯琼脂［附录5.9］5对照用菌液取大肠杆菌［CMCC(B)44102］的营养琼脂斜面培养物少许，接种到5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24H后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌液加入量含菌50～100个(一般用量为0.1ml)，其菌数在做阳性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。6准备6.1供度品的检验量［见细菌，霉菌(酵母菌)计数5.3］6.2供试液的制备6.2.1液体供试品［见细菌，霉菌(酵母菌)计数6.2.1］6.2.2固体，半固体或粘稠液供试品［见细菌，霉菌(酵母菌)计数6.2.2］6.2.3非水溶性供试品［见细菌，霉菌(酵母菌)计数6.2.3］6.2.4含抑菌成分供试品供度品按常规检查法，加入规定量的对照菌.不能检出时，该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查，同时做阳性和阴性对照。6.2.4.1稀释法取规定量的供试液种入较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。6.2.4.2离心沉淀集菌法取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，300r/min离心30min，移去上清液，留底部集菌液约2ml，并稀释该供试液至原规定量.如有不溶性药渣，可先以500r/min离心5min，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。6.2.4.3薄膜过滤法，取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。6.2.4.4中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液(含1%对氨基苯甲酸约1～5ml)中；含砷，汞类的供试品，于硫乙醇酸培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚出梨酯80等表面性剂的100ml增菌液中(表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用)。6.2.4.5沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。7操作步聚供试品质7.1检验程序供试品质供试液MUG蛋白胨 供试液MUG蛋白胨BL增菌培养液BL增菌培养液EMB或麦康凯琼脂平板EMB或麦康凯琼脂平板 36±1℃ 18～24h36±1℃ 18～24h 疑似菌落纯培养36±1℃ 5、24h疑似菌落纯培养 36±1℃18～24h地区性MUG阴性，靛基质阳性；MMUG阴性，靛基质阳性；MUG阳性，靛基质阴性；MUG阴性，靛基质阳性；革兰染色，乳糖，靛基质、甲基红、V-P、枸橼酸盐利用革兰染色，乳糖，靛基质、甲基红、V-P、枸橼酸盐利用报告 18～24h

36±1℃24～48h报告7.2增菌培养取胆盐乳糖(BL)培养基3瓶，每瓶各100ml.2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌50～100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照.37℃培养18～24h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液，供试品阳性对照培养液，阴性对照培养液各0.2ml分别加入MUG一蛋白胨培养基(培养基5.7)管，37℃培养4、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加欧一波试液4～5滴于上MUG管内，观察液面颜色.MUG阳性(有荧光)，靛基质阳性(玫瑰红色)，报告检出大肠杆菌；MUG阴性(无荧光)，靛基质阴性(无色)，报告未检出大肠杆菌。7.3分离培养如MUG阳性，靛基质阴性或MUG阴性，靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌。表1大肠杆菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂(EMB)典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽.非典型菌落呈浅紫色，粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽.麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润.非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色.当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供度品抑菌成分的影响.有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色，镜检、IMViC试验。7.4纯培养如生长菌落与表1所弄特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团(紫黑色，或有金属光泽)，应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。7.5革兰染色，镜检7.5.1以接种环沾取无菌水于洁净玻上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次(载玻片不烫手)固定。7.5.2滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。7.5.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。7.5.4滴加95%乙醇，脱色20～30s，水洗。7.5.5滴加沙黄液，复染1min，待干后，镜检。7.5.6染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色，大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。7.5.7注意事项7.5.7.1玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓，否则，菌细胞成堆或连成片，染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。7.5.7.2培养物的菌龄以16～24h为宜.培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。7.5.7.3脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。8生化试验8.1乳糖发酵试验，取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色)，产气(小倒管内有气泡，气泡无论大小)。为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管.绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌.可于24h出现阳性.或适当延长培养时间。8.2靛基质试验(I)取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48h，沿管壁加入欧一波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性.一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作规程先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，作下的蛋白胨水培养物再培养24h，作靛基质试验。8.3甲基红试验(M)取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液加入甲基红指示液2～3滴(约每ml培养液加指示液1滴)，轻轻摇动，立即观察，呈鲜红色桔红色为阳性，呈黄色为阴性。８.4乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄胨水培养基中，培养48±2h，于2ml培养液中加入a-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h(通常在30min)内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。8.5枸橼酸盐利用试验（C）取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。9结果判断9.1当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性，供试品MUG阳性，靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。MUG阴性，靛基质阳性，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。9.2MUG阳性，靛基质阴性，IMViC试验为一十一一，革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阳性，IMViC试验为十十一一，革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。供试品培养物检查不符合9.2二项中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。10注意事项10.1MUG法不必从混合菌中分离单个菌落，除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属，沙门菌属的菌株，以及少数革兰阳性球菌，杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性.因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰，至于志贺菌，沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出.既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌，沙门菌。10.2配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后PH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光.分装MUG培养基的试管应挑选，试管、