新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测标准操作规程

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测标准操作指导书操作步骤试剂准备区进行取出-20℃保存的试剂盒，并将试剂盒批号、过期日期等信息记录在《PCR检测记录表》上,从试剂盒取出2019-nCoV反应液，解冻，上下颠倒混匀后，点动离心；取X个0.2mlPCR八连管（X=样本数目，包括质控品数量）放在PCR管架上。将PCR反应液分装至八连管中，每管分装20μl（17ulNC(ORFlab/N)反应液A和3ulNC(ORFlab/N)反应液B），盖好所有的PCR管盖，通过传递窗传送至标本制备区进行加样。剩余部分要在试剂盒上标记：开启人、开启日期和剩余人份。新冠病毒RNA的提取新冠病毒RNA的提取1.2.1.1将室温放置96孔试剂板颠倒3次，去除塑封膜后在96孔板离心机中短暂离心（或手甩），避免挂液。撕去96孔试剂板上的铝箔膜，确认板子方向（磁珠在第6/12列）。1.2.1.2在96孔板的第1及第7列孔中加入200µL样品，避免交叉污染。1.2.1.3将96孔板放入Smart32核酸提取仪中，装上磁棒护套。1.2.1.4按以下程序进行自动化提取实验：1.2.1.5自动化程序结束后，将第6及第12列的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中；如不马上使用，请将洗脱液转移至新的1.5mL无核酸酶离心管中，零下20度保存。PCR扩增在样本制备区的生物安全柜中进行加样操作，并使用干净的手套进行实验操作。取出提取的RNA保存离心管，摆放在1.5ml离心管架上，若经过冷冻处理，则需进行解冻，振荡混匀后进行点动离心。根据RNA上的编号对准备好的PCR混合液进行编号。打开PCR管盖，分别用干净的滤芯枪头加入5uL对应编号的样本RNA至PCR混合液中。每一次实验需要同时扩增三个阴性质控（1份生理盐水，2份阴性样本）和1个弱阳质控。加完模板的枪头应小心打入废液缸中，并确保移液器前臂没有碰到废液缸口。加完所有模板后，仔细核对加样顺序与编号是否正确，确保每个反应管的加样无误。确定每个八连管的盖子盖紧后，在微型离心机上进行点动离心去气泡（或在扩增区微型离心机上进行），并通过传递窗传送至扩增区进行扩增。以达安AGS4800定量PCR操作为例：打开程序软件，按样本对应顺序设置空白质控品、阴性质控品、阳性质控品以及未知样本；探针检测模式设置为：Reporter1：FAM，Quencher1：NONE；Reporter2：VIC，Quencher2：NONE；Reporter3：Cy5，Quencher3：NONE将八连管放入PCR仪中，整体按压管盖使其压紧，在《48孔板工作表》记录每个样本在PCR仪上的位置，确认程序正确并已启动后，实验人员方可离开，进行PCR反应。室内质控质控品来源名称来源阴性质控留样生理盐水外购阳性质控第三方质控室内质控方法每个批次标本的检测均需有留样检测、生理盐水及阳性对照参与提取-扩增的全过程，全程操作同标本的处理。只有连续评价结果在控，本实验室测定工作可靠，检验报告才可发出。失控判断规则阴性质控品：FAM和（或）VIC检测通道有明显扩增曲线；Cy5通道无明显扩增曲线；阳性质控品：FAM和VIC检测通道任意一个或两个通道无明显扩增曲线；Ct值>32，Cy5通道有或无扩增曲线；空白质控品：任意一个通道或所有通道有明显扩增曲线；以上规则任意一个满足均为失控，需重新进行试验。失控处理分析并填写《失控分析报告》结果解释结果判读10.1.1.如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值>40，且Cy5通道有扩增曲线，可判样品未检测到2019新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA；10..1.2.如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，可判样品为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）阳性。10.1.3.如果检测样品仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一通道无扩增曲线，结果需复检，复检结果仍为单通