发酵工程制药

第三章发酵工程制药第一节概述发酵工程

FermentationEngineering

1微生物发酵技术

1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。

同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。

2一、发酵的定义1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵31、传统发酵

最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。42、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。53、工业上的发酵

泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。6发酵工程定义

发酵工程是渗透有工程学的微生物学。它是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机的结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。是将传统发酵技术与DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。7发酵工程制药的研究范畴1、抗生素2、维生素3、氨基酸4、核苷或核苷酸5、药用酶和辅酶6、其它药理活性物质8维生素发酵生产的维生素，1982年世界产量为6万吨左右，六种维生累的总销额为6.7亿美元。在1969—1980年间，每年销售量递增10×，1981—1991年间仍以7一8％的速率递增。目前，全球范围内使用最为普遍的是VA、VC和VE，三都每年市场销售额近20亿美元，其中VE超过10亿美元，其余为VB族，每个品种都有0.5-1.5亿美元的市值。在各种用途中，维生素作为动物饲料的市场正以每年2-3％速度增长，在药用和食品领域都以4-5％的速度增长。9发酵工程的生产流程发酵工业的生产过程：原料预处理培养基配置发酵设备和培养基的灭菌无菌空气的制备菌种的制备和扩大培养发酵（微生物培养）发酵产品的分离和纯化10菌种制备1112工艺特点与要求A.菌种制备品系纯正、生产能力高、遗传稳定无污染、生命力强、保存期短严格消毒灭菌定期分离复壮冷冻干燥管或液氮管保存菌种13菌种筛选摇瓶试验发酵罐试验纯种培养14微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。15一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。16一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥17

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。18国际重要菌种保藏机构19中国菌种保藏单位2021二、工业微生物菌种保藏技术

(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；

(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏22菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法

穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法

砂土管保藏法滤纸片保藏法

冷冻干燥保藏法

液氮冷冻法

232.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。24冷冻保藏种类

一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60-80℃)三、液氮冷冻保藏技术

25普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年26应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。27二、超低温冷冻保藏技术(-60--80℃)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：

1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；

2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；

3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；

4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。28如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。29三、液氮冷冻保藏技术

(一)冷冻保护剂

在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

30(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液的制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。

31(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。32

2．控速冷冻．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；33(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。34(三)复苏1．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。352.2

冻干保藏

冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。36培养物的冻干过程37冷冻真空干燥操作流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度包藏38(三)冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。2．复苏：(1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。39(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。402.3传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。412.3传代培养法实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。操作方法

1、斜面保藏法将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。422、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。43矿物油中浸没保藏将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。44浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。452.4载体法

实验原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。46操作方法（砂土管保藏法）（1）河砂处理取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（２）土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。

(3)砂土混合处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。472.4

基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。48当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。49不同菌种保藏方法比较50细菌的保藏51放线菌菌种的保藏保藏方法主要有：

沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法放线菌菌种的长期保藏依保藏放线菌的分生孢子为主要方式。52发酵原料的预处理原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉——利用前需变成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜——加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐。3.碳氢化合物：石油脱蜡——一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10℃的油，加入适量无机盐进行接种发酵。53菌种斜面培养菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种。方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。保存的菌种菌种活化种子扩大培养54种子扩大培养扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。固体种子扩大培养一般采用传统的制曲工艺，一般先用克氏瓶或茄子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养。需氧微生物：将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇床上振荡培养。厌氧微生物：将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养。克氏瓶和茄子瓶55摇瓶克氏瓶和茄子瓶摇床培养摇瓶培养是一种能保证好氧菌获得充足溶解氧的液体培养方法56

菌种的衰退与复壮

在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。

57在长期接触菌种的实际工作人员中，都有这样的体会，即如果对菌种工作长期放任自流，不搞纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，反映到生产上就会出现持续的低产、不稳产。这说明菌种的生产性状也是不进则退的。58菌种衰退的表现对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。生长速度缓慢，产孢子越来越少。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。

59菌种衰退的实质菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。60复壮的概念狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。

61二、菌种的衰退与复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。大量群体中的自发突变菌种的复壮：a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；菌种衰退的特点：62实践中关于防止菌种衰退和进行复壮的经验

（一）衰退的防止

1．控制传代次数

2．创造良好的培养条件

在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。如改变培养基成分、改变培养温度等。3．利用不同类型的细胞进行接种传代。用灭过菌的棉团进行孢子接种，不同孢子的接种尝试。634．采用有效的菌种保藏方法，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种生产性状的衰退

64（二）菌种的复壮

1．纯种分离。通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。

65方法662．通过宿主体内生长进行复壮。对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。

3．淘汰已衰退的个体，如低温抗性筛选67发酵工艺的特点与要求原料要求质量稳定原材料、设备、空气要严格灭菌设备密封性好无菌压缩空气分阶段控制68无菌空气的制备空气除菌：针对好氧发酵空气除菌过程高空采风空气压缩机加压灭菌（加热或过滤）69提炼工艺的特点与要求低温、清洁、严格控制环境工艺组合优选质量把关安全意识严格的无菌概念70酵母生产燃料乙醇71第二节抗生素类药物概述抗生素：antibiotics

由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及甚至用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下万种。72抗生素的发现很早以前，人们就发现某些微生物对另外一些微生物的生长繁殖有抑制作用，把这种现象称为抗生。随着科学的发展，人们终于揭示出抗生现象的本质，从某些微生物体内找到了具有抗生作用的物质，并把这种物质称为抗生素，如青霉菌产生的青霉素，灰色链丝菌产生的链霉素都有明显的抗菌作用。73抗生素杀菌作用抗生素杀菌作用主要有4种机制

抑制细菌细胞壁的合成：抑制细胞壁的合成会导致细菌细胞破裂死亡，以这种方式作用的抗菌药物包括青霉素类和头孢菌素类，哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这些药物的影响。

与细胞膜相互作用：一些抗菌素与细胞的细胞膜相互作用而影响膜的渗透性，这对细胞具有致命的作用。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌素。

干扰蛋白质的合成：干扰蛋白质的合成意味着细胞存活所必需的酶不能被合成。干扰蛋白质合成的抗生素包括福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素。

抑制核酸的转录和复制：抑制核酸的功能阻止了细胞分裂和/或所需酶的合成。以这种方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。74命名、分类命名:按动植物学、菌属学名称定：青霉素

按化学结构或性质的族名定：四环素纪念意义：地名、习惯俗名：井冈霉素分类：a.按来源分：真菌、细菌、放线菌、动植物

b.按作用对象分：抗革兰氏阳性菌（G﹢菌）抗革兰氏阴性菌（Gˉ菌）、

抗肿瘤、抗真菌、抗结核分支杆菌、抗病毒、噬菌体及原虫

c.按作用机制分：抑制细菌壁、细胞膜、蛋白质合成、核酸、生物能作用等

d.按化学结构分：β-内酰胺类、大环内酯类、四环类、氨基糖苷类、多烯大环类、多肽类、苯羟基胺类、蒽环类、其他等75青霉素青霉素又被称为青霉素G、peillinG、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。

青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。

76四环素从放线菌金色链丛菌（Streptomycesaureofa-ciens）的培养液等分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素，对结核菌、变形菌等则无效。作用机制是与核蛋白体的30S亚单位结合，而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合。

77抗生素的抗菌谱指一种或一类抗生素（或抗菌药物）所能抑制（或杀灭）微生物的类、属、种范围。如青霉素的抗菌谱主要包括革兰阳性菌和某些阴性球菌，链霉素的抗菌谱主要是部分革兰阴性杆菌。窄谱抗生素广谱抗菌素：四环素类的抗菌谱覆盖面广，包括一些革兰阳性和阴性细菌，以及立克次体、支原体、衣原体等78抗生素的剂量表示法效价单位：抗生素的活性表示方法每毫升或每毫克中所含某种抗生素的

有效成分理论效价、实际效价表示方法：a.稀释单位：最高稀释度、最小剂量U/ml;U/mg初期表示方法

b.质量单位：以有效成分的质量作为抗生素的单位U/mg79常用抗生素的理论效价

多为1μg作为一个单位，如链霉素、土霉素、红霉素等1000U/mg同一类抗生素各种盐类效价可根据分子量进行换算链霉素碱1000U／mg

土霉素碱1000U／mg红霉素碱1000U／mg

金霉素盐酸盐1000U／mg

四环素盐酸盐1000U／mg青霉素钠1667U／mg

80第三节抗生素药物的生产一、β-内酰胺类分子内含β-内酰胺环—具抗菌活力与细菌青霉素结合蛋白(PBPS)结合、抑制形成肽聚糖应用最广泛、品种最多代表：青霉素和头孢菌素81β-内酰胺类抗生素的基本结构特征82β-内酰胺类抗生素作用机制细菌细胞壁结构

所有的细菌都具有环绕着细胞膜的细胞壁。细胞壁的主要功能是：保持细胞形态，以及保护细胞免受由于环境渗透压变化造成的细胞溶解。传统地可以把细菌分为革兰阳性菌、革兰阴性菌和耐酸菌三种。

83β-内酰胺类抗生素作用机制在这三种细菌的细胞壁中都具有肽聚糖组分，其由N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramicacid，NAM））和N-葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，NAG）。

NAM和NAG紧密连接成线状，线与线之间通过连接在NAM和NAG上的内肽桥的连接成片状（图），片与片的堆积成为细胞壁的肽聚糖（图）。

84肽聚糖片的形成85β-内酰胺类抗生素作用机制近年来对细菌细胞膜进行了深入研究，发现细菌的细胞膜上有特殊的蛋白质分子，能与β-内酰胺类抗生素结合，被称之为青霉素结合蛋白(PenicillinBondingProteins，PBPs)，抑制交联形成肽聚糖。它具有很高的转肽酶和羟肽酶活力，是这类抗生素抑制作用的靶蛋白。86β-内酰胺类抗生素的性质物理性质：结晶固体羧基以游离酸存在时，易溶于有机溶剂—提取羰基具有较高红外光谱振动频率——鉴别化学性质：开环反应易进行，与醇类作用较快——重结晶87青霉素的生产工艺1.生产孢子制备产黄青霉菌孢子高产青霉菌的获得：1943年在一个发霉的甜瓜上分离到一种产黄青霉菌，产量也只有20单位/ml，因此价格非常昂贵。后来该菌株经X－射线和紫外线诱变处理后得到一变异株WisQ176，青霉素产量最高达1500单位/ml，为挽救在第二次世界大战中战伤受细菌感染而濒临死亡的伤员生命,发挥了重大的作用。目前工业生产上采用的生产菌种均为该变种通过采用理化因素不断进行诱变选育，当前青霉素发酵产量已达50000—60000单位/ml的高水平88青霉素的发酵工艺流程产黄霉菌斜面孢子米孢子种子罐发酵罐发酵液发酵滤液真空冷冻干燥或液氮保藏孢子琼脂斜面培养基25℃培养7~9d斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质25℃培养6~7d孢子悬浮液接种26℃通气搅拌培养60~68h10-15%体积接种在25通气搅拌补料分批培养200~240h冷却至5℃絮凝、过滤补料：葡萄糖硫酸铵氨水、苯乙酸消泡剂89青霉素的提炼工艺流程溶剂萃取法低温、快速、严格控制PH、减少污染发酵液冷却除杂萃取结晶干燥90二、大环内酯类抗生素的生产最初使用的大环内酯是红霉素，它是礼来公司的研究队在菲律宾怡朗的土壤中，从红霉素链霉菌中抽取出来。并于1952年，在美国首次以月桂酰的商标出售红霉素、碳霉素、酒霉素、麦迪霉素、竹桃霉素、螺旋霉素等。竹桃霉素9192大环内酯类抗生素的作用机制一般认为：大环内酯类抗生素为蛋白质合成抑制剂，即阻断50S中肽酰转移酶中心的功能，使P位上的肽酰tRNA不能与A位上的氨基酰tRNA结合形成肽键(如图所示)。大环内酯类抗生素与50S核糖体亚单位可逆性地结合，阻断肽链的延伸

93分类1.多氧大环内酯类抗生素根据碳原子数目分为3类：12元环、14元环和16元环大部分为碱性：医疗用14元环：红霉素、竹桃霉素16元环：吉他霉素、螺旋霉素2.多烯大环内酯类抗生素根据所含共轭双键的数目分为四烯、五烯、六烯、七烯等类抗菌活力随共轭双键数目的增加而增加可引起真菌细胞膜通透性的改变、导致致病菌死亡，而对细菌无效3.蒽沙大环内酯类抗生素共同的结构：环桥化合物利福霉素94红霉素Erythromycin抗菌谱与青霉素近似，对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用。对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、以及流感嗜血杆菌、拟杆菌也有相当的抑制作用。临床上主要用于治疗呼吸道感染、皮肤与软组织感染、胃肠道感染。适用于青霉素过敏者有红霉素A\B\C\D95红霉素的生产1.菌种红色链霉菌：主要是红霉素A2.发酵工艺96红霉素的发酵工艺流程红色链霉菌斜面孢子米孢子种子罐发酵罐发酵液发酵滤液真空冷冻干燥或液氮保藏孢子琼脂斜面培养基37℃避光培养7~10d优良孢子接种于大米或小米基质37℃培养7~9d孢子悬浮液接种35℃通气搅拌培养65h31℃

pH：6.6~7.2冷却、沉淀、过滤补料：葡萄糖（每6H)氨水、丙酸消泡剂（豆油、菜油）繁殖罐孢子悬浮液接种33℃通气搅拌培养40h97红霉素的提取精制工艺发酵液滤洗液杂质蛋白质较多硫酸锌ph7.2-7.8NaOH去除溶剂萃取法大孔树脂吸附法效价不高丙酮结晶效价高收率高98四环素类抗生素

分子中含有四个并联环对革兰氏阳性菌、阴性菌（除铜绿假单胞菌）、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素，对结核菌、变形菌等则无效。作用机制是与核蛋白体的30S亚单位结合，从而抑制其蛋白质合成。

1.长期使用易使细菌产生抗药性2.副作用较多:四环素牙99四环类抗生素(tetracyclines)是四环素、土霉素、金霉素、地美环素、美他环素、多西环素(强力霉素)、米诺环素等天然和半合成抗生素的总称。自40年代末这一类抗生素的第一个成员金霉素问世以来,由于它具有抗菌谱广、毒性低、口服吸收良好以及价格低廉等优点,很快成为继青霉素之后的又一类最广泛应用的抗生素。除了主要用于人类的疾病医疗外,在畜牧业上还用于防治牲畜疾病和作为饲料添加剂促进家禽家畜的生长。

品名分子结构中文名英文名R2R5R6R6’R7金霉素chlortetracyclineHHOH-CH3Cl土霉素oxytetracyclineH