微生物感染的诊断与防治

微生物感染的诊断与防治1第一页，共七十九页，2022年，8月28日微生物学诊断Microbiologicaldiognosis病原学诊断血清学诊断直接依据间接依据第一节微生物感染的诊断2第二页，共七十九页，2022年，8月28日（一）细菌学诊断标本的采集和送检四原则区别取材尽快送检无菌操作妥善处理3第三页，共七十九页，2022年，8月28日无菌采集

严格无菌操作，避免标本被污染。标本收集于无菌容器中，容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂处理。4第四页，共七十九页，2022年，8月28日取样部位

不同疾病、不同时期取不同部位标本如流脑病人取CSF、血液或出血瘀斑；伤寒病人在病程1～2周内取血液，2～3周时取粪便。尽可能取病变明显部位的材料取局部病变标本，不可使用消毒剂，必要时以无菌生理盐水冲洗，拭干后取材。5第五页，共七十九页，2022年，8月28日早期采集

采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，且必须在抗菌药物使用前，否则这份标本在分离培养时要加入药物拮抗剂。6第六页，共七十九页，2022年，8月28日

一般标本采集后最好在2h内送检，大多细菌可4℃冷藏运送、特殊（如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌）需保温立即送检。粪便标本中杂菌多，常置于甘油缓冲盐水保存液中。尽快送检、冷藏运送

7第七页，共七十九页，2022年，8月28日（二）病原菌的检验程序检查致病菌

1、形态学检查

examinationinmorphology直接镜检：形态和染色性上有特征的致病菌，直接涂片镜检后有助于初步诊断。如：痰中查抗酸性杆菌，脓液中找G+葡萄串状球菌，霍乱弧菌等。8第八页，共七十九页，2022年，8月28日葡萄球菌霍乱弧菌9第九页，共七十九页，2022年，8月28日AB结核分枝杆菌A.结核分枝杆菌培养的镜下形态(抗酸染色)B.结核分枝杆菌痰标本直接涂片(抗酸染色)10第十页，共七十九页，2022年，8月28日2、分离培养（isolationandcultivation）：

所有标本均应作分离培养获得纯培养后进一步鉴定，根据不同要求选用不同培养基。分离培养比直接涂片镜检阳性率高，但需时较久；大多细菌16～24h，结核杆菌需4～8w。

分离培养是微生物学诊断的金标准。11第十一页，共七十九页，2022年，8月28日分离培养

isolationandcultivation

分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术。（图为普通孵箱）12第十二页，共七十九页，2022年，8月28日

厌氧箱厌氧袋13第十三页，共七十九页，2022年，8月28日

各种细菌所具有的酶不完全相同，对营养物质的分解能力亦不一致，因而其代谢产物有别，藉此可对不同致病菌进行鉴别（如肠道杆菌）。3、生化试验糖发酵试验14第十四页，共七十九页，2022年，8月28日4、血清学试验：

含特异抗体的免疫血清＋未知纯种细菌进行血清学实验，可确定致病菌的种和型。常见有玻片凝集试验。玻片凝集试验15第十五页，共七十九页，2022年，8月28日5、动物试验：主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性等。常用动物：小鼠、豚鼠、家兔接种途径：皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内等。16第十六页，共七十九页，2022年，8月28日6、药物敏感试验

测定标本中致病菌对药物的敏感程度；对指导临床用药及控制感染有重要意义。常用纸碟法和试管稀释法。17第十七页，共七十九页，2022年，8月28日检测致病菌的成分病原菌的抗原病原菌的核酸：免疫荧光ELISA对流免疫电泳…PCR杂交：Southern，检测DNANorthern，检测RNA

原位杂交斑点杂交18第十八页，共七十九页，2022年，8月28日19第十九页，共七十九页，2022年，8月28日分子生物学技术

molecularbiologicaltechniques

核酸杂交

nucleotidehybridization

原位杂交

insituhybridization

斑点杂交

dotblot

Southernblot

Northernblot

PCR技术：多聚酶链反应

(polymerasechainreaction,PCR)20第二十页，共七十九页，2022年，8月28日（三）血清学诊断

采用已知的细菌或其特异性抗原，检测患者血清或其他体液中有无相应特异性抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。21第二十一页，共七十九页，2022年，8月28日在血清学诊断中，最好采取患者急性期和恢复期双份血清标本。结果：以抗体效价明显高于正常人水平或患者恢复期抗体效价比急性期升高≥4倍方有意义。常用有凝集实验、沉淀实验、补体结合实验、中和试验、ELISA等。22第二十二页，共七十九页，2022年，8月28日

肥达试验

玻片凝集实验23第二十三页，共七十九页，2022年，8月28日细菌学诊断基本方法24第二十四页，共七十九页，2022年，8月28日二、病毒学诊断25第二十五页，共七十九页，2022年，8月28日病毒诊断包括哪些步骤和方法？检测内容查抗原查特异性抗体

病毒颗粒病毒抗原病毒核酸病毒酶类：如逆转录酶

电镜直接观察光镜检查包含体分离培养26第二十六页，共七十九页，2022年，8月28日

1、采集时间：用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本，应采集病人急性期标本。血清学检查的标本最好取双份。

2、标本种类：根据不同病毒感染采集不同部位标本(如鼻咽拭子、脑脊液、血液、粪便或疱疹液)。

（一）标本的采集原则27第二十七页，共七十九页，2022年，8月28日3、标本运送：应立即送检，运送标本中注意冷藏。保存于含抗生素的运送液中。不能立即送检时应存放于-70℃低温冰箱或液氮内保存。4、标本处理：有杂菌标本应用高浓度抗生素处理（4℃）并离心。28第二十八页，共七十九页，2022年，8月28日细胞培养（cell

culture）动物接种（animalinoculation）

鸡胚接种（egginoculation）（二）病毒的分离与鉴定29第二十九页，共七十九页，2022年，8月28日1、动物接种最原始的病毒培养方法。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。如：狂犬病病毒小鼠脑内柯萨奇病毒乳鼠腹腔或脑内乙型脑炎病毒小鼠脑内优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高，动物体内常

带有潜伏病毒30第三十页，共七十九页，2022年，8月28日2、鸡胚培养绒毛尿囊膜/尿囊腔/羊膜腔/卵黄囊31第三十一页，共七十九页，2022年，8月28日痘苗V、HSVIFV、腮腺炎VIFV嗜神经V32第三十二页，共七十九页，2022年，8月28日优点：易管理，不带微

生物，成本较低缺点：操作程序复杂33第三十三页，共七十九页，2022年，8月28日

流感病毒分离培养的最好方法是鸡胚接种。接种羊膜腔（初次分离），尿囊腔（传代）；然后取羊水或尿囊液做血凝和血凝抑制试验鉴定。血凝试验：羊水/尿囊液+鸡RBC红细胞凝集表明有病毒存在和增殖34第三十四页，共七十九页，2022年，8月28日

血凝实验35第三十五页，共七十九页，2022年，8月28日3、细胞培养

是从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。36第三十六页，共七十九页，2022年，8月28日病毒的细胞培养细胞培养瓶单层细胞37第三十七页，共七十九页，2022年，8月28日细胞培养的优点：来源方便，容易选择易感细胞。无免疫力，利于病毒生长。培养条件易于控制：可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分。接种量大：细胞可以大量生产，而且还可较久地持续培养。动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制。加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速，早出结果。38第三十八页，共七十九页，2022年，8月28日（1）细胞类型原代细胞动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长。（人胚肺细胞，鸡胚细胞、猴肾细胞、兔肾细胞等）39第三十九页，共七十九页，2022年，8月28日二倍体细胞在体外连续培养50～60代仍保持其二倍染色体数目的细胞。为生产人用疫苗的首选细胞株。传代细胞能在体外连续传代，来自肿瘤细胞或发生自发转化、突变的原代细胞或二倍体细胞株。40第四十页，共七十九页，2022年，8月28日

优点缺点用途原代细胞

多种V敏感来源困难、成本高、分离携带潜伏病毒二倍体细胞

多种V敏感来源易,50代诊断/疫苗制备传代细胞

无限传代，来源易致瘤性分离/鉴定/研究V41第四十一页，共七十九页，2022年，8月28日（2）病毒在细胞内增殖的指征①细胞的变化细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)：病毒在细胞内增殖后，可引起细胞形态学改变，如细胞肿胀、变圆、皱缩、融合或细胞聚集成葡萄串状，甚至细胞溶解或脱落等，这种可在普通光镜下看到的由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为CPE。包涵体42第四十二页，共七十九页，2022年，8月28日细胞病变效应（CPE）43第四十三页，共七十九页，2022年，8月28日44第四十四页，共七十九页，2022年，8月28日包涵体形成45第四十五页，共七十九页，2022年，8月28日②红细胞吸附现象某些病毒感染的宿主细胞能吸附脊椎动物的红细胞。③干扰现象46第四十六页，共七十九页，2022年，8月28日4、病毒的鉴定（1）病毒种类与型别鉴定初步鉴定：动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形态、乙醚敏感试验、耐酸试验）等。最后鉴定：主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、IFA和ELISA等）和分子生物学方法。47第四十七页，共七十九页，2022年，8月28日（2）病毒感染性测定50%组织培养感染量（50%tissuecultureinfectivedose，TCID50）：

引起半数培养细胞发生病变（CPE）的病毒量。蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：

在细胞培养表面覆盖一层半固体物质使细胞病变形成蚀斑。48第四十八页，共七十九页，2022年，8月28日病毒标本（充分稀释）↓单层细胞↓37℃，60min，吸附，洗涤覆盖琼脂↓37℃，3～5d观察蚀斑（中性红/结晶紫染色）PFU/ml：定量测定病毒感染性49第四十九页，共七十九页，2022年，8月28日（三）血清学诊断中和试验：中和试验是指病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究其抗原结构。中和抗体特异性高，维持时间较长，因此流行病学常用此法。50第五十页，共七十九页，2022年，8月28日血凝抑制试验：许多病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称为血凝现象。这种现象能被相应抗体所抑制，称血凝抑制试验。常用于含血凝素的病毒（如流感病毒、乙脑病毒）的辅助诊断和流行病学调查。补体结合试验：可作为近期感染的指标。ELISA：可检测多种病毒抗体，应用广泛。51第五十一页，共七十九页，2022年，8月28日形态学检查1、光学显微镜检查：检查包涵体2、电子显微镜检查：如轮状病毒、冠状病毒等病毒抗原检查

有免疫荧光（IFA）、放射免疫技术、酶免疫技术（EIA）等。（四）病毒感染的快速诊断52第五十二页，共七十九页，2022年，8月28日轮

状

病

毒53第五十三页，共七十九页，2022年，8月28日特异性抗体（IgM）的检测：

如：HAV、风疹病毒和针对EBV早期抗原的抗体；用于急性感染，特别是先天性感染的诊断。检测病毒核酸：

包括核酸分子杂交技术和PCR，如HBV、HCV、HSV、CMV等的检测。

54第五十四页，共七十九页，2022年，8月28日三、真菌学诊断（一）标本采集的原则

55第五十五页，共七十九页，2022年，8月28日（二）病原性真菌的分离与鉴定1.直接镜检不染色标本：皮屑、毛发、指（趾）甲屑等置玻片上，加10％KOH、微微加温，软化角质。轻压盖玻片，使标本变薄透明，然后镜检。如观察到菌丝和孢子，可初步诊断。染色标本：GS、墨汁负染2.分离培养标本处理后接种沙保培养基或血平板上，观察菌落及菌丝孢子形态等加以鉴定，必要时作小培养。56第五十六页，共七十九页，2022年，8月28日3.动物实验4.核酸的检测5.真菌毒素的检测57第五十七页，共七十九页，2022年，8月28日第二节微生物感染的防治原则58第五十八页，共七十九页，2022年，8月28日一、细菌感染的特异性防治

特异性防治是应用特异性免疫的原理，给机体注射或服用病原微生物抗原（包括类毒素）或特异性抗体以达到预防和治疗感染性疾病的目的。这种方式称为人工免疫。人工免疫分为人工主动免疫和人工被动免疫两种。59第五十九页，共七十九页，2022年，8月28日（一）人工主动免疫人为地将疫苗（vaccine）或类毒素接种于人体，使机体主动产生特异性免疫力的一种防治微生物感染的措施。常用人工主动免疫制剂有：

60第六十页，共七十九页，2022年，8月28日常用制剂疫苗

----灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗、转基因植物疫苗和治疗性疫苗。类毒素61第六十一页，共七十九页，2022年，8月28日1.死疫苗：选用免疫原性强的细菌经人工大量培养后，用理化方法杀死而成。如伤寒、百日咳、霍乱等。优点：易于保存。缺点：接种剂量大；维持时间短；接种次数多；注射的局部和全身性副反应较大；不产生细胞免疫应答。62第六十二页，共七十九页，2022年，8月28日2.减毒活疫苗：

用减毒或无毒力的活病原体制成；如BCG优点：只需接种一次、接种剂量较小、副反应轻微或无、免疫效果好且持久、能同时产生细胞免疫和体液免疫；以自然途径接种，有SIgA抗体的局部粘膜免疫形成。缺点：不易保存（冷藏且保存期短）、回复毒力的危险性63第六十三页，共七十九页，2022年，8月28日区别点死疫苗活疫苗制剂特点死，强毒株活减毒株接种剂量与特点量较大，2~3次量较小，1次保存及有效期易保存，约1年不易保存免疫效果较低，体液免疫，维持数月~2年较高，体液及细胞免疫均有，维持3~5年甚至更长死疫苗与活疫苗的区别64第六十四页，共七十九页，2022年，8月28日3.亚单位疫苗：

用化学方法裂解和提取或通过基因工程产生的细菌保护性抗原组分制成的疫苗。如:脑膜炎球菌的荚膜多糖，乙肝疫苗等。65第六十五页，共七十九页，2022年，8月28日4.核酸疫苗／DNA疫苗／基因疫苗

将能编码诱发保护性免疫应答的病原体基因片段和能在真核细胞表达的质粒重组，直接注入宿主体内使其表达目的免疫原，进而诱导出保护性抗体和细胞免疫的新型疫苗。核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。66第六十六页，共七十九页，2022年，8月28日类毒素：

外毒素经0.3～0.4%甲醛作用3～4周后，毒性消失仍保持免疫原性的制品。如白百破三联疫苗（DPT）是将白喉类毒素、百日咳死菌苗、破伤风类毒素混合而成。67第六十七页，共七十九页，2022年，8月28日

（二）人工被动免疫

给机体注射含特异性抗体的免疫血清或纯化免疫球蛋白抗体，或细胞因子等制剂，使机体即刻获得特异性免疫力的过程，以治疗或紧急预防感染。人工被动免疫常用试剂有：68第六十八页，共七十九页，2022年，8月28日1、抗毒素：

一般用细菌类毒素或外毒素多次免疫马后采血，从血清中提取免疫球蛋白精制而成。抗毒素能中和相应的外毒素，阻断其毒性作用。例如用于白喉、破伤风等疾病。注射前需做皮肤试验。应早期、足量注射。

69第六十九页，共七十九页，2022年，8月28日2、抗菌血清3、胎盘球蛋白/丙种球蛋白

主要用于免疫力低下的人或者球蛋白缺乏患者。4、免疫细胞和细胞因子

IFN-γ、IL、CSF等70第七十页，共七十九页，2022年，8月28日区别要点

人工主动免疫

人工被动免疫免疫物质抗原或类毒素抗体或细胞因子免疫出现时间慢，2～4周快，立即免疫维持时间长，数月～数年短，2～3周