第十五章DNA的复制、修复和重组

Chapter15DNA的复制、修复和重组

1.掌握遗传信息传递的中心法则。2.掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。3.了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的复制过程。4.了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制：错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要的酶类；了解DNA损伤修复的意义。目的要求

1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录及RNA的复制存在于RNA病毒

中心法则病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶作用下，生成DNA的过程。几个基本概念Reversetranscription中心法则图示§1DNA的代谢一、DNA代谢包括DNA复制、修复和重组二、大肠杆菌遗传图

遗传图：通过遗传学方法测定的一物种各基因沿着染色体相对顺序和位置的排列图。

一、关于模板的概念

二、DNA的半保留复制

1.定义以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。2.半保留复制的实验证据1958年Meselson和Stahl用15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。§2DNA复制的一般规律全保留与全新复制分散复制半保留复制DNA半保留复制图示半保留复制的证明

Meselson和Stahl将15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌DNA都带上15N标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后,分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N,14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N,14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N,14N～14N1:7)亲代DNA与子二代DNA的混合物亲代DNA与子四代DNA的混合物复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图DNA半保留复制的生物学意义DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物。三、DNA复制的起点与方向双向复制单向复制复制中的DNA

复制原点复制叉DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）四、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。半不连续复制的发现日本学者冈崎（1968）：用3HdT标记T4噬菌体感染大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶缺失的变异株时，检测到大量DNA小片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。一、DNA是由DNA聚合酶催化合成的原料：四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链,

也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH。合成方向：53§3DNA聚合酶

1956年，Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：二、DNA复制的精确性（高保真复制）

DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：（1）碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。（2）DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。（3）DNA的损伤修复系统。三、大肠杆菌三种DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶，含一个锌原子。为多功能酶，具有:（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（校对功能）；（3）还具有5’3’外切酶活性（双链有效）；该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。

DNA聚合酶催化的反应ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"DNA聚合酶Ⅱ

多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。DNA聚合酶Ⅲ含十种亚基:(αβγθτδδ’χΨε)，其中(αεθ)称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。亚基相对分子量亚基数目基因亚基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校对功能组建核心酶使核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成DNA

聚

合

酶

Ⅲ

的

异

二

聚

体前导链的合成滞后链的合成DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋DNAPolⅠDNAPolⅡDNAPolⅢ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300四、DNA复制许多酶和蛋白因子

拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶,在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，催化拓扑异构体之间互变的酶称为拓扑异构酶。拓扑异构酶І

使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。二者共同控制DNA的拓扑结构。两类拓扑异构酶作用特点

解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2ATP分子。单链结合蛋白稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。

引物合成酶催化引物RNA的生成。引发前体它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动，具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。参与DNA复制的酶

与蛋白因子总览图§4细胞DNA复制的阶段性（以大肠杆菌为例）一、复制的起始阶段1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成二、复制的延长阶段三、复制的终止阶段复制原点oriC和原点的识别

DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点，常用oriC（或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都富含A、T区段。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链（DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB），在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。复制原点oriC和原点的识别1.拓扑异构酶解开超螺旋。2.DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp重复序列。3.在类组蛋白（HU）、ATP参与下,DanA蛋白变性13bp的重复序列，形成开链复合物。4.DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5.单链结合蛋白结合于单链。6.引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。一、复制的起始二、链的延长

真核生物的冈崎片段为：100-200bp

原核生物的冈崎片段为：1000-2000bpDNA链的延伸

在DNA聚合酶Ш催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链延伸的同时进行前导链和滞后链合成。两条链方向相反。

前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接

前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体DNA连接酶不仅能连接双链DNA的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。DNA连接酶作用机理三、复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱

Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。大肠杆菌DNA

复制的终止连环、解连环四、真核生物DNA复制的特点1.真核生物染色体有多个复制起点，称自主复制序列(ARS)或复制基因(replicator)；多复制眼，呈双向复制，多复制子。2.冈崎片段长约200bp，相当于核小体长度。3.真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000～3000bp/Min（仅为原核生物的1/20～1/50）。4.真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多复制起点。5.真核生物有多种DNA聚合酶，DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的复制酶，在增殖细胞核抗原（PCNA）存在下有持续合成能力。PCNA相当于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。6.真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶。7.RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口。DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复(POLⅠ)真核细胞内有五种DNA聚合酶细菌和真核生物复制体的组成组成细菌真核生物复制酶POLⅢ全酶POLα/POLδ进行性因子Β夹子增殖细胞核抗原定位因子γ复合物RF-C(夹子装配器)引物合成酶DnaGPOLα除去引物RNaseH和POLⅠRNaseH和MF-1滞后链修复POLⅠ和DNA连接酶POLε和DNA连接酶解螺旋酶DnaB（旋转酶）T抗原消除螺旋张力旋转酶TOPⅡ单链结合SSBRP-A真核细胞DNA复制示意图五、复制起始的时序控制六、逆转录（reversetranscription）定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。用DNA复制的特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。

以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化。单链病毒RNA

RNA-DNA杂交分子双链DNA（前病毒）

逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53’方向合成DNA，底物为四种dNTP,并要求短链RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+致癌RNA病毒的逆转录过程

逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性

RNA指导的DNA聚合酶活性；

DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用;无校对功能，错误率高，易产生变异。逆转录病毒的生活史

cDNA：反义DNA几乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA，当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与该mRNA互补的DNA，称cDNA。逆转录酶发现的理论与实践意义：不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤防治提供了新的线索。目前，逆转录酶已经成为研究工具。

1983年，发现人类免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus），感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS），该病毒为逆转录病毒。

因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家

端粒（telomere）是真核染色体末端的特殊结构，它一般含许多串联重复的寡聚核苷酸序列，通常是TxGy的形式，x、y常为1-4。端粒结构提出了一个特别的生物学问题。DNA复制需要引物，但在线形DNA分子中，DNA复制结束后，引物去除留下的链的短缺无法进行补缺，若没有特殊的机制解决末端复制，DNA就会因为复制而不断变短。这个问题是由一种特殊的酶—端粒酶（telomerase）解决的。端粒酶，端粒的合成酶，含有一段RNA和蛋白质，其中的RNA成分为150个核苷酸，并含1.5个拷贝的与端粒互补的重复序列CyAx，这是端粒TxGy合成的模板。端粒酶是以该段RNA为模板的逆转录酶，端粒合成时以该段RNA为引物和模板，合成因引物切除而产生的DNA末端缺口，使染色体的端粒达到正常的长度。端粒酶是一种逆转录酶端粒的合成

DNA的损伤与DNA突变DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致死亡。§5DNA修复

DNA突变

DNA的核苷酸顺序永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有：1.点突变DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。2.插入作用DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。3.缺失作用DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。

沉默突变：突变影响非必需的DNA或突变对一个基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。

回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。

☏缺失、插入和移框突变；5'.....GCAGUACAUGUC..3'

丙缬组缬

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谷酪蛋丝

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