微生物细胞破碎

微生物细胞破碎第一页，共三十三页，2022年，8月28日几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒症干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤第二页，共三十三页，2022年，8月28日§3、1细胞壁的组成与结构第三页，共三十三页，2022年，8月28日

脂蛋白脂多糖脂质双层形态与结构细胞壁特殊组分：外膜第四页，共三十三页，2022年，8月28日一、细菌肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸磷壁质糖脂质第五页，共三十三页，2022年，8月28日G+

菌肽聚糖结构:五肽交联桥五个甘氨酸四肽侧链L-丙、D-谷、L-赖、D-丙聚糖骨架G：N-乙酰葡萄胺M：N-乙酰胞壁酸第六页，共三十三页，2022年，8月28日聚糖骨架：同G+

菌四肽侧链：

L-丙、D-谷

DAP、D-丙G-菌肽聚糖结构:第七页，共三十三页，2022年，8月28日细胞壁革兰阳性菌革兰阳性菌强度较坚韧较疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖层数可多达560层1-2层肽聚糖含量占细胞壁干重50%-80%占细胞壁干重5%-20%磷壁酸有无外膜无有细胞壁G+菌与G-菌细胞壁的比较第八页，共三十三页，2022年，8月28日项目革兰阳性菌革兰阴性菌细胞壁的关系染色性紫色红色细胞壁对酒精的通透性抗原性主要为磷壁酸主要为外膜细胞壁的化学组成不同毒性无内毒素有内毒素内毒素为阴性菌细胞壁成分

脂多糖对青霉素的作用有效无效青霉素作用部位为肽聚糖五肽交联桥对溶菌酶的作用有效无效溶菌酶作用部位为肽聚糖

聚糖骨架细胞壁G+菌与G-菌的差别及与细胞壁的关系第九页，共三十三页，2022年，8月28日细胞膜位于细胞壁内紧包细胞质，结构与真核细胞基本相同。功能细胞膜电镜照片分泌呼吸载体蛋白脂质双层细胞膜模式结构图物质转运生物合成第十页，共三十三页，2022年，8月28日特殊结构荚膜化学组成：功能：肺炎链球菌肺炎链球菌Capsule多糖或多肽抗吞噬作用粘附作用抗有害物质损伤作用产汽荚膜杆菌第十一页，共三十三页，2022年，8月28日二、真菌和酵母糖及其氨基衍生物氨基酸脂质三、藻类

第十二页，共三十三页，2022年，8月28日四、细胞结构与细胞破碎细胞声波搅拌液压冷冻压力动物细胞7777G-芽孢杆菌和球菌6566G+芽孢杆菌5（4）54酵母3.5342.5G+球菌3.5(2)325孢子2(1)21菌丝16(1)5细胞对破碎的敏感度第十三页，共三十三页，2022年，8月28日§3、2细胞壁的破碎一、破碎率的评价破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：1、直接计数法平板计数法血球细胞计数器2、间接计数法产物测定法电导法

第十四页，共三十三页，2022年，8月28日第十五页，共三十三页，2022年，8月28日二、细胞破碎方法的分类细胞破碎机械非机械液体剪切固体剪切超声波：超声波机械搅拌：振动器压力：Chaikoff挤压机研磨：研棒、研钵、珠磨压力：X-压滤机干燥溶胞物理：渗透冲击化学：阴、阳离子洗涤剂酶：溶菌酶、酶噬菌体溶胞真空干燥空气干燥冷冻干燥溶剂干燥第十六页，共三十三页，2022年，8月28日1、固体剪切方法（珠磨）原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一齐搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。第十七页，共三十三页，2022年，8月28日设备第十八页，共三十三页，2022年，8月28日破碎率的动力学方程破碎作用遵循一级动力学定律：Rm能使放出的蛋白质最大数量(mg/g)R为t时间内释放的蛋白质数量(mg/g)k破碎的比速度第十九页，共三十三页，2022年，8月28日影响反应常数K的因数：转盘外缘速度细胞浓度珠粒大小温度流量提高破碎率的方法：延长研磨时间增加珠体装量提高搅拌速度提高操作温度第二十页，共三十三页，2022年，8月28日2、液体剪切法（高压匀浆法）原理：利用高压使细胞破碎。不宜采用高压匀浆的破碎的微生物细胞：已造成堵塞的团状或丝状真菌；较小的革兰氏阳性菌；含有包含体的基因工程菌

高達20,000PSI(約138MPA)以上的壓縮氣體，可以有效的將細胞膜打破。第二十一页，共三十三页，2022年，8月28日包含体形成的可能性：可溶蛋白的集聚超过溶解度；蛋白合成太快，导致分子间疏水相互作用聚合而不溶；高表达的蛋白没有形成正常的二硫键连接；蛋白的助溶物缺乏；包含体的形成与蛋白的稳定性有关。包含体:蛋白相互交联在一起形成不溶性的聚集物

第二十二页，共三十三页，2022年，8月28日外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包含体-丙酰胺酶20%在细胞区间-人体干扰素25%形成包含体凝乳酶原形成包含体牛生长激素〉30%形成包含体-内酰胺酶形成区间包含体人胰岛素原6%~26%形成包含体第二十三页，共三十三页，2022年，8月28日破碎的动力学方程：R：蛋白质释放量；Rm：蛋白质最大的释放量；p：操作压力；k：速率常数；：与微生物种类有关的常数第二十四页，共三十三页，2022年，8月28日Doulach理论：Z：常数P：破碎压力P0：临界压力：细胞浓度参数第二十五页，共三十三页，2022年，8月28日3、超声波破碎法（液相剪切的一种方法）原理：超声波引起空穴，在相当高的输入声能下，液体各部分会形成许多小气泡，在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能在压缩时，气泡破破裂，释放出猛烈的阵。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量身能转化成弹性形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。第二十六页，共三十三页，2022年，8月28日蛋白释放的动力学方程：蛋白释放常数k取决于输入的声能。破碎效果:杆菌>球菌;革兰氏阴性>革兰氏阳性;细菌>酵母.第二十七页，共三十三页，2022年，8月28日超声波破碎过程中的影响参数：振幅；细胞悬浮液的粘度；表面张力；被处理悬浮液的体积；探头的形状和材料；细胞悬浮液的流速；第二十八页，共三十三页，2022年，8月28日机械放破碎的缺点：需要高的能量并且生产高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活；破碎非专一性；碎片尺寸分布广泛。第二十九页，共三十三页，2022年，8月28日4、酶溶法原理：利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破壁的一种方法。优点：产品的选择性高；抽提的速率和收率高；产品破坏最少；对pH和温度等外界条件要求底；不留细胞残片。缺点：酶的费用高；通用性差；产物抑制分类：外加酶法；自溶法第三十页，共三十三页，2022年，8月28日重要微生物细胞壁的降解酶生物体酶水解键的类型细菌糖苷酶N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶多肽酶肽聚糖中AGA和AAM之间的（1、4）-键残基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁酰基残基和L-氨基酸残基之间的键；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽键。真菌、酵母-（1，3）-葡聚糖酶-（1，6）-浦聚糖酶甘露聚糖酶甲壳素酶蛋白酶聚糖中随机（1，3）-键聚糖中随机（1，6）-键（1，2）-或（1，3）-或（1，6）--D甘露糖苷键甲壳糖和壳糊精中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基（1，4）-B-键藻类纤维素酶纤维素中的（1，4）-键第三十一页，共三十三页，2022年，8月28日5、化学法原理：用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法。优点：对产物有选择性细胞外形保持完整，碎片少。缺点：通用性差时间长有些化学试剂有毒性用于化学法的试剂种类：酸碱调节有机溶剂表面活性剂