蛋白质与酶工程第一章

酶工程第一章绪论

酶是活细胞分泌的具有催化功能的生物大分子。按它的化学本质分为蛋白质类酶（P－酶）和核酸类酶（Ribozyme，R-酶）。酶工程及其内容酶工程(enzymeengineering)又称酶技术，是酶制剂的大批量生产和应用的技术。它是综合现代技术发展起来的一门应用性很强的学科。酶的分离提纯化学修饰，固定化人工酶的化学合成酶源：微生物动植物工业：食品、纺织、制药、畜牧业等化学与高分子技术研究与医学酶与其他生物工程的关系近代生物工程酶工程基因工程细胞工程发酵工程蛋白质工程目前世界上已经发现的酶目前已发现和鉴定的酶大约有2500多种，在工业上有应用前景的50-60种，大规模生产和应用的仅16种，小批量生产的也仅200来种。酶在工业上应用受到限制的原因有两个方面：（1）大多数酶在脱离生理环境后极不稳定，而酶在生产和应用过程中的条件与生理环境差别很大；（2）分离纯化酶的技术复杂、繁锁，酶制剂成本高，价格贵，不利于广泛应用。根据酶工程研究和解决问题的手段不同，将其分为化学酶工程和生物学酶工程。化学酶工程

被称初级酶工程（primaryenzymeengineering），是酶学原理与化工技术相结合的产物，它是指在一定的生物反应装置中利用酶的催化作用将相应的原料转为有用物质的技术，它是在发酵工程上发展起来的。它包括了以下几种酶：自然酶是指从材料中提取制成酶制剂，应用于纺织、食品、制药、畜牧等行业的酶制剂的研究和应用，这类酶每年以8%速度增长，主要是一些水解酶类如蛋白酶（59%）、糖酶（29%）。这类酶的特点：A价格低，生产方式简单；B应用不复杂，不需要辅因子参与，但产品种类少，应用范围窄。这类酶的应用有力地促进工业技术革新和技术内容。如化学合成的可的松的价格为每克200美元，改用酶法合成每克仅36美分。如木瓜蛋白酶作为饼干松化剂、啤酒澄清等。化学修饰酶通过酶分子的化学修饰达到改构改性的目的，“生物大分子工程”或对酶分子实行手术。主要应用于理论研究和医药用酶。

医学用酶:A无免疫原性；B半衰期长；C易于进入细胞。固定化酶将酶分子通过吸附、交联、包埋和共价键结合等方法束缚于某种特定的支持物上，而发挥酶的作用。并在此基础上发展为固定化细胞。酶和活细胞原生质体固定化，是酶工程的中心任务。已广泛应用于国民经济多个方面。具有强大的生命力，在医药上尤为突出。人工合成酶依据酶的催化原理，模拟酶的催化能力，用化学合成法人工合成的催化剂。人工酶的制备有两种，即半合成法和全合成法。其中最为突出的例子是抗体酶、酶分子印迹技术。非水相催化

酶不但在水中起催化作用，而且能在有机溶剂中也起催化作用。生物酶工程指酶学原理和以基因工程为主的现代分子生物学技术的产物，又称为高级酶工程。新酶分子基因蓝图新酶突变酶克隆酶蛋白质结构与功能克隆酶：用基因工程技术大批量生产酶，目前已经克隆成功的酶基因有100多种，有的已应用于生产如尿激酶、链激酶、凝乳酶等。突变酶：修饰酶基因，产生遗传修饰酶。新酶：设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶，主要目的是创造新的优质酶，用于高价特殊药品和超自然的生物制品的生产。酶工程任务

酶制剂的分离纯化，大批量生产及新酶的开发。酶和活细胞的固定化。酶生产中基因工程技术的应用。酶分子的改造、化学修饰、产物应用及结构与功能的研究。酶应用性开发。酶反应器和传感器的研究。酶的抑制剂与激活剂的研究与应用。模拟酶、合成酶、酶分子人工设计合成的研究。抗体酶、酶非水相催化的研究与应用。发展动态1、在新酶的开发方面：将注意分解高分子物质的酶及使低分子有机物聚合、检测与分解有毒物质、综合利用的酶。2、利用基因工程技术开发新酶种和提高酶产量。3、酶、活细胞及多酶体系的固定化及应用。4、用微生物、动植物细胞研究生物传感器。5、非水相催化、酶的化学修饰与分子改造、高效催化剂的人工合成。酶技术在食品工业中的应用

一、酶在淀粉加工中的应用应用于淀粉加工中的酶种类很多，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等等。（一）

葡萄糖的生产酸水解工艺缺点很多：①需用耐酸、耐压设备；②需用精制淀粉为原料；③水解后需中和、色泽深，精制费用大；④淀粉投料浓度低，仅20%；⑤葡萄糖收率低，不超过90%；⑥水解时当DE值达到80%，因逆聚合反应生成-键带苦味的龙胆二糖等低聚糖，要精制除苦；⑦久贮后还因生成氧化甲基糠醛而转变为褐色。

目前国内外普遍采用酶法生产葡萄糖。采用粗淀粉为原料，投料浓度可达50%（干物质计），得率高达110%，因不需要中和等环节，杂质含量低，不需精制直接喷雾干燥成葡萄糖粉。此法简要步骤是：以淀粉作成30-40%粉浆，在pH6~6.5时加入-淀粉酶，90C左右液化到碘反应消失，冷却到55~60C，在pH4.5~5.0时加入酶化酶，保温糖化48h左右，几乎全部淀粉转化为葡萄糖，再经脱色浓缩，结晶或喷雾干燥即为产品，DE值达98%以上。目前世界上淀粉糖达1000多万吨。

（二）高果糖浆的生产

葡萄糖异构酶的正确名称为D-木糖异构酶（EC5.3.1.5），它能将D-木糖、D-葡萄糖、D-木碳糖等醛糖异构化为酮糖，其中葡萄糖异构化为果糖具有重要经济意义，所以也被称为葡萄糖异构酶。果糖富有果香味，其甜度为蔗糖的120~160%，为葡萄糖的2~3倍。

目前生产中采用固定化酶和固定化细胞。主要有：①采用壳聚糖吸附戊二醛交联及腊酸纤维包埋戊二醛交联等方法制备含酶固定化细胞（微生物）；②采用EDAE-纤维素、阴离子交换树脂、多孔氧化铝、多孔海土菜吸附制备固定化酶，再将固定化酶或细胞装柱制成酶反应器，在pH7.2~8.0流经含Mg2+葡萄糖溶液。1kg固定化细胞可生产2000~3000kg高果糖（干物质）、1kg固定化酶可生产6000~8000kg高果糖。目前采用离子交换柱吸附果糖，可使其含量达90%以上。高果糖浆（HCS）或称异构糖浆广泛用于饮料、糕点、冷饮、罐头、蜜饯等食品。目前在国外约为500万吨，占淀粉糖的1/2、占食用糖的2/3。

（三）饴糖的生产

饴糖具有独特风味，是食品工业的重要原料。主要成分是麦芽糖和糊精。主要是用-淀粉酶和-淀粉酶，由于小麦麸皮和麦芽中含大量-淀粉酶，生产中用以代替-淀粉酶。

（四）功能性低聚糖的开发

随着功能性食品开发热潮的涌现，功能性低聚糖的开发也不断升温，目前已形成较大规模。

目前市场上已出售的功能性低聚糖主要有偶合糖、帕拉金糖、环状糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、乳糖低聚糖、低聚木糖、麦芽低聚糖、异麦芽低聚糖、二蔗酮糖、绵子糖、海藻糖等产品。

目前主要采用糖基转移酶生产低聚糖（如下表）

低聚糖原料所用酶低聚果糖乳蔗糖木酮基蔗糖帕拉金糖偶合糖异麦芽低聚糖龙胆低聚糖半乳糖低聚糖蔗糖蔗糖、乳糖蔗糖.半乳糖蔗糖蔗糖、淀粉麦芽糖葡萄糖乳糖-果糖基转移酶-果糖基转移酶-果糖基转移酶-葡萄糖基转移酶环状糊精葡萄糖转移酶（GTase）-葡萄糖苷酶（麦芽糖酶）-葡萄糖苷酶-半乳糖苷酶二、蛋白质相关酶的应用（一）

用于生产蛋白食品原料（1）甜味剂制造中的应用。如：Cbz－Asp＋Phe－OMeCbz－Asp－Phe－OMeH－Asp－Phe－OMe比蔗糖甜200倍固定化中性蛋白酶Pd－c（巴碳）(2)在动物产品加工的副产品中的应用利用明胶、干酪素、鱼粉等这些动物产品的副产品，经调浆后用蛋白酶水解，再经灭酶、脱色、杀菌、真空浓缩和喷雾干燥等可以制得水解蛋白粉，它们具有优异的保水性、乳化性、不易产生沉淀；有良好的抗氧化性，对易变化食品起保护稳定性作用；有良好表面活性、溶解性、润滑性，能改善调整食品的风味和结构品质；极易被人体吸收，改善人体多种功能，促进儿童生长发育。作为添加剂在火腿、香肠等肉制品、果奶饮料、味精、保健食品、乳制品等食品中广泛应用。（3）在生产淀粉的副产品面筋蛋白中应用

面筋蛋白含有较多的疏水氨基酸，限制了其在食品中的应用，利用中性蛋白酶水解后乳化性、溶解性、起泡性等功能特性大大提高，作为品质改良剂在面包、灌肠等食品生产中应用。除小麦面筋外，其它植物蛋白如大豆蛋白、玉米蛋白等都可以通过酶处理方法来改善其功能性。

（4）在动物血、杂鱼（虾）、碎肉加工中应用

利用蛋白酶水解作用，从动物血、杂鱼、碎肉中提取蛋白质作为食品或饲料，这是开发人类新食品蛋白的有效措施。（5）在植物蛋白的加工、改造中应用

除了上述对面筋改造外，大豆蛋白加入蛋白酶处理以提高其溶解性具有特别重要的意义。自从FDA认可大豆蛋白可以减轻心脏病以来，其相关产品在国际市场明显增长，日本豆奶市场目前已超过10万吨。玉米蛋白是一种储存蛋白，在pH2~5之间溶解性差，当用胰蛋白酶处理后在同样的pH条件下，溶解度可达30~50%。

（二）蛋白酶在改善食品质量中的应用

（1）肉类嫩化

（2）饼干、糕点膨化（3）转谷氨酰胺酶（EC2.3.2.13）的应用

与一般蛋白质水解酶相比，转谷氨酰胺酶在蛋白质加工中具有显著特点，它作用于蛋白质中谷酰胺残基，通过转酰胺作用，使之与Lys残基结合，形成一定的架桥结构，从而提高蛋白质的凝胶性能。该酶已应用于水产制品、乳制品、畜肉制品等的加工。(4)啤酒、饮料的澄清（三）制备生物活性物质

蛋白质在体内以氨基酸或肽的形式被吸收，近年来发现小肽类（2~7个氨基酸）在吸收代谢中具有重要生理功能。活性肽（功能肽）目前认头的定义是对机体构成一套高度自动化的物质。是沟通细胞间、血管间联系的信使，为外分泌、内分泌、神经系统行使传递功能，从而使机体组成了高度严密的系统，促进生长发育和繁殖的正常进行。

三、油脂加工的相关酶食用油脂市场规模约250万吨，其中特定的保健食品所需的专用油脂制品市场呈发展趋势。

1.

构造油脂

用固定脂肪酶水解菜子油，利用脂肪酶的脂化交换反应以及脂化合成反应中，得到的中长度脂肪酸的改性油脂，都易于消化利用，统称为构造油脂。2.

生产功能性油脂采用酶法生产一些功能性油脂取得了较大进展，特别是DHA等高度不饱和脂肪酸作为功能性食品基料已形成较大的市场规模。酶法生产DHA所用酶主要来自酵母的脂肪酸，通过对其进行选择性水解，可制得富含DHA的甘油脂，而且缩合反应以及酰基转移反应使DHA含量达50%以上的甘油脂。3.在油脂加工中酶的应用在植物油的抽提过程中常会用到一些复合酶，如果胶酶、半纤维素酶、蛋白酶等来分解植物细胞壁成分，以便有效地抽提出其油脂。

目前在油脂加工课题是如何降低反式脂肪酸的生成，提高有益脂肪酸的利用性，应用酶研发油脂的健康功能。在这方面利用酶的非水相催化将有很大的发展。

4.其它方面的应用（1）面粉改良脂肪酶是一种天然、健康的面粉改良剂。它能水解面粉中脂肪，产生甘油二脂和甘油单脂，起到良好的乳化效果，提高面团的耐发酵能力，具有增筋增白双重作用。

（2）手性化合物合成

利用脂肪酶的立体、位点选择性催化外消旋化底物的某一对应体，从而获得所需的手性化合物。具有适应种类多、反应条件温和、专一性强和副产物少等优点。目前水解化生产手性化合物的催化剂大约有30%采用脂肪酶。脂酶和脂肪酶在有机相中催化脂类的合成，目前在代替化学催化剂的手性合成研究中发展极为迅速。四、酶在乳制品工业中的应用

乳制品加工中酶的应用主要有以下几方面：乳糖-分解乳糖；凝乳酶制造干酪素；溶菌酶杀菌消毒；过氧化氢消毒等。1.乳制品中乳糖的分解

牛奶中乳糖含量约为4.5%。乳糖进入机体后经小肠黏膜状缘的乳糖酶（EC3.2.1.23），-半乳糖苷酶分解成葡萄糖和半乳糖。如缺乏乳糖酶乳糖不能分解为单糖，被肠道微生物发酵生成有机酸（乙、丙、丁酸等）和气体（CH4、H2、CO2等），这个发酵过程引起人肠鸣、腹痛、排气和腹泻等症状，统称为“乳糖不耐症”。乳糖缺乏是一个广泛的世界问题。据调查，亚洲人75-100%、欧洲白人5-30%、非洲人90-100%、美国白人12%、黑人70%、我国成人88.9%、儿童87%。乳糖进入体内后半小时至数小时内发病。因此，乳糖的消化吸收和营养价是世界乳制品业的重大课题。在乳制品工业中广泛应用乳糖酶。2、奶酪的生产牛乳中蛋白质含量占93.3%，其中酪蛋白78%，酪蛋白包含s1-酪蛋白、-酪蛋白以及-酪蛋白，它们的比例为3：1：1。全世界生产牛奶约1亿多吨，其中奶酪生产占牛奶生产总产量的1/4。干酪的生产分为二步：第一步，用乳酸菌将牛奶发酵成酸奶；第二步，用凝乳蛋白酶将可溶性-酪蛋白水解成不溶性Para--酪蛋白和糖肽：凝乳酶位点

N－Pro·His·Leu·Ser·Phe·Met·Ala·Ile·Pro·Pro·C不溶性Para－κ－酪蛋白糖肽在酸性条件下，加入微量Ca2+和酶使之凝固后，再经切块、加热、压榨、熟化便制成干酪。

凝乳酶来自于小牛皱胃（第4胃），为此全世界每年宰杀4000多万头小公牛。酶源不足，价格贵。现在将其酶基因克隆到大肠杆菌中，由大肠杆菌生产所代替。使该酶成为仅次于淀粉酶的大商品酶。

3、乳品加工中的其它酶的应用

溶菌酶（胞壁质酶）,加入鲜奶中增加人体的抗菌能力，防止肠道感染。H2O2酶用以除去牛奶中多余的H2O2，以达牛奶消毒。SOD用于乳清的脱色；巯基氧化酶用于去除乳制品超高温杀菌而产生的糊味；脂肪酶用于乳制品增香。

五、面粉烘烤加工中酶的应用

酶在烘烤食品方面的应用可以增大面包体积、改善表皮色泽、改良面粉质量、延缓陈变、提高柔软度、延长保存期限。1．在国外向面粉中添加0.1%的淀粉酶，能提高产品品质，因此常以面粉中淀粉酶活力作为面粉质量指标之一。2．制作面包时，加入蛋白酶，使面团易于延伸，以加速成熟。3、在生产蛋糕过程中，蛋液为主要原料，要求具有良好的乳化性和持泡性，通过加入蛋白酶，可以得到良好的效果。

4．脂肪氧化酶添加于面粉中可以使面粉中的不饱和脂肪酸氧化，同时胡萝卜素发生共轭氧化作用而将面粉漂白。5．乳糖酶加入到脱脂奶粉的面包制作中，乳糖生产发酵粉，促进酵母发酵，改善面包色泽。6．小麦和黑麦面粉中存在一定数量戊聚糖妨碍胶原蛋白形成面包的结构，采用半纤维素酶分解戊聚糖，从而起到提高胶原蛋白的粘弹性作用。7．加入蔗糖酶，可以防止糕点中蔗糖析出。面包制作过程中还常用半纤维素酶与淀粉酶混合使用起到良好的效果。六、酶在酒类酿造中的应用1、啤酒以大麦芽为原料。在工艺中常加入α-淀粉酶、β-淀粉酶、脱支酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶以处理原料，解决啤酒发酵中酶活不足问题。2、啤酒澄清3、啤酒发酵初期酵母在发酵液中生成α-乙酰乳酸，它又会转变成双乙酰影响风味，双乙酰又可转变为无色无臭的乙酰甲基甲醇。在发酵初期加入α-乙酰乳酸脱羧酶加速α-乙酰乳酸转变为乙酰甲基甲醇，大大缩短成熟时间。4.糖化酶代替麸曲，用于制造白酒、黄酒、酒精，可以提高出酒率，节省粮食，简化设备。5.果胶酶、酸性蛋白酶、淀粉酶用于制造果酒，改善果实的压榨过程，使果酒澄清。七、酶在饮料工业中的应用1.在果汁制造中，压榨时加入果胶、纤维素酶和半纤维素酶能起到破坏植物组织、提高榨汁效率、缩短榨汁时间、提高榨汁得率等。在榨汁中加入果胶酶水解果胶，能防止混浊、缩短过滤时间，有时也添加淀粉酶防止淀粉对过滤的影响，以提高透明度。2．柑橘类果汁中因含有柚皮苷，加入柚皮苷酶来降解它从而达到脱苦的效果。

3．目前茶饮料市场呈现不断上升的趋势，在茶的保藏过程中，其成分咖啡因与聚合型儿茶酚会形成复合物，从而导致沉淀产生。采用加入单宁酶来降解儿茶酚为没食子酸，得以解决沉淀问题。

4.开发豆奶及大豆食品市场最大的问题是产品的豆腥味，含有β-环糊精的环状糊精葡萄糖转移酶（CGTase）可以除去豆奶中的豆腥味。异黄酮的糖苷配基若使用β-葡萄糖苷酶处理可以提高3倍，并可促进其在体内的吸收。5．其它使用咖啡饮料的半乳甘露聚糖酶、用于红茶饮料的单宁酶、防止苹果汁及桃汁褐变的绿茶酸脂酶等均在开发中。八、酶在食品保鲜和贮藏中的应用

1.食品除氧保鲜氧气是影响食品质量的因素之一。除氧问题一般采用葡萄糖氧化酶（EC1.1.3.4）和过氧化氢酶：

H2O2酶H2OC6H12O6+O2C6H12O7+H2O22.蛋类食品脱糖

蛋白中含有0.5~0.6%葡萄糖，它与蛋白质反应生成小黑点，并影响其溶解性，因此必需脱糖。将适量葡萄糖氧化酶加到蛋白液或全蛋液中，通入适量氧气，使葡萄糖完全氧化，从而保持蛋制品的色泽和溶解性。

3.酶法灭菌保鲜

微生物污染会引起食品变质、腐败，灭菌方法很多，如添加防腐剂、加热等。但这些方法可能引起食品品质的改变，防腐剂可能给人体健康带来不良影响。采用溶菌酶，不但效果好，而且不存在食品安全问题。溶菌酶（Losozyme，EC3.2.1.17）已广泛应用于干酪、水产品、啤酒、清酒、鲜奶、奶油、生面条等食品中。九、酶在食品添加剂生产中的应用

食品添加剂按功能不同而分为酸味剂、增味剂、甜味剂、乳化剂、增稠剂、强化剂等，酶作为安全、高效的生物催化剂，在食品添加剂的生产中已较为广泛应用。

1、酸味剂生产中的应用

（1）乳酸生产

L-乳酸：丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+

D-乳酸生产：

丙酮酸＋NADH＋H＋D－乳酸

＋NAD＋

L－2－氯丙酸＋H2O肌肉中乳酸为D－型，而酸奶中为D－和L－等混合外消旋型。（2）苹果酸的生产延胡索酸＋H2OL－苹果酸L－LDHD－LDHL－2－氯卤代酸脱卤酶D－乳酸固定化延胡索酸酶1．增味剂的生产中增味剂又称鲜味剂，已知有40多种，如味精、肌苷酸钠等。酶在食品增味剂生产中主要用于氨基酸和呈味核苷酸的生产。

（1）呈味L-Aa酶法生产氨基酸类增味剂是当今世界用量最大、最广的一种食物增味剂。我国许可使用的只有L-GluNa的一种，国际上一些国家许可的还有L-Glu、L-Glu铵、钾、钙及L-Asp钠。通过酶法或固定化酶生产L-Ala增味剂的主要有：蛋白酶水解蛋白质生成L-Ala，再分离鲜味Aa；Glu脱氢酶催化AKG加氨还原生成L-Glu；转氨酶催化α-酮酸与Aa转氨反应生成L-Glu；L-Glu合成酶催化AKG与Gln反应生成L-Gln；Asp酶催化延胡索酸氨基化生成L-Asp。

（2）呈味核苷酸的酶法生产主要有GMP和肌苷酸。以RNA为底物，在5’-P-二脂酶催化下生成4种核苷酸混合物。由AMP脱氨酶催化AMP脱氨，生成肌苷酸（IMP）等。

3.甜味剂生产中应用

（1）天冬肽生产如前所述。（2）葡萄糖转移酶生产帕拉金糖。

其反应为：2-D-吡喃葡萄糖苷蔗糖-1，2，吡喃果糖

葡萄糖苷转移酶2-D-吡喃葡萄糖苷-1，6呋喃果糖（帕拉金糖）

（3）果聚糖蔗糖酶生产低聚果糖低聚果糖是指在蔗糖的糖基上结合1~2个果糖分子而形成的非还原糖，它存在于洋葱、香蕉等果蔬中。含量低。其甜度约为蔗糖的60%。

55~60%蔗糖溶液

（4）β-葡萄糖醛酸苷酶生产葡萄糖醛酸甘草皂甙

β-葡萄糖醛酸苷酶（EC3.2.1.31）是一种催化β-葡萄糖醛酸苷水解，释放出β-葡萄糖醛酸的水解酶。

甘草皂甙是一种三萜皂甙，由甘草皂甙元与2分子的以β-1，4糖苷键连接的β-D-葡萄糖醛酸组成。甘草皂甙及其钠盐低热值的味剂具有免疫调节和抗病毒等功能。其甜度为蔗糖的170~200倍，已应用于乳制品、蛋制品以及羊肉除膻增香等。

固定化含果聚糖蔗糖酶黑曲霉菌

60℃，24h低聚果糖4．在乳化剂生产中的应用目前，国内外普遍采用的乳化剂是甘油羊脂和大豆磷脂等。利用脂肪酸可将甘油三脂水解为甘油羊脂，并结合分子蒸馏得含量达90%以上的单脂和40~50%的单双脂混合物。5.风味酶的发现与应用在食品中添加各种特有的风味酶，则可恢复甚至强化原有的天然风味。

食品工业新酶开发与应用

原有酶的用途不断扩大、新酶不断开发这为食品工业不断注入了新的活力。

（一）菊糖酶

菊糖主要存在于菊科植物中，菊糖是D-呋喃果糖通过β-1，2-糖苷键连接而成的长链多糖，水解β-D-1，2-呋喃果糖糖苷键的酶有2种：一是β-D-1，2-果聚糖水解酶（EC3.2.1.7），为内切酶，产物为寡聚果糖；另一类β-D-1，2-呋喃果糖苷果糖水解酶（EC3.2.12.6）专一性催化菊糖水解生成果糖，成为利用菊糖的工具。利用菊糖酶生产果糖，比利用淀粉酶糖化D-木糖异构酶生产异构糖浆工艺简便，成本大幅降低。该酶存在于细菌、酵母菌、霉菌及蜗牛中。

（二）海藻糖生产的酶类

海藻糖由2个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成的非还原型二糖，90年代以后用酶法