第十二章细胞增殖及其调控

第十一章细胞增殖与细胞分裂第十二章细胞增殖及其调控前言细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生物繁育的基础。各种细胞在分裂之前，还必须进行一定的物质准备。物质准备和细胞分裂是一个相互连续的过程，这一过程即为细胞增殖(cellproliferation)。需要在细胞中必须有一个严格的监控系统，监控着细胞周期运转中每一个环节，从而保证遗传的稳定。研究细胞周期与细胞分裂的意义绝大多数真核生物个体生长繁殖的基础；使遗传物质DNA在细胞世代中得以延续的保证；高等生命通过细胞的有丝分裂结合细胞分化，形成组织、器官、系统,维持和完成生命活动；此过程机制复杂，搞清楚对癌症治疗具重大意义；

细胞增殖有十分精确的调控机制，表现出严格的时间和空间的顺序性，如果异常就会产生疾病。如造血细胞生成的速率小于血液中细胞死亡的速率，就会造成贫血；机体局部细胞无休止的分裂就会产生肿瘤；细胞增殖过程中染色体分配异常就会导致染色体病。所以探讨细胞增殖的机理对于医学的理论和实践有十分重要的意义。第一节细胞周期概述

一、细胞周期1．细胞周期的发现：细胞有丝分裂期(mitosis)和位于两次分裂期之间的分裂间期(interphase)或静止期；1953年，Howard和Pelc的32P标记蚕豆实生苗根尖实验发现：DNA的复制仅发生在静止期中的一个区段；将细胞周期划分为4个时期：S期(DNA合成期)、M期(有丝分裂期)、G1期(M期结束到S期之间的间隙)、G2期(S期结束到M期之间的间隙)。细胞在细胞周期中顺序经过G1-S-G2-M而完成其增殖。2、细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个序贯过程。在这一过程中，细胞遗传物质复制，各种组分加倍，然后平均分配到两个子细胞中。3．周期中细胞，终端分化细胞，G。期细胞从增殖的角度，细胞可分为三类：连续分裂的细胞，静止期细胞和终端分化细胞。连续分裂的细胞即在细胞周期中连续运转的细胞，因而又称周期中细胞。小肠绒毛上皮隐窝细胞，表皮基底层细胞，部分骨髓细胞够均属此类。静止期细胞为暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞，如某些免疫淋巴细胞，肝、肾细胞等，也称为G。期细胞。终末（端）分化细胞是指那些不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，保持生理机能活动的细胞，如神经、肌肉细胞、多形核白细胞等。细胞周期时间

不同生物细胞的细胞周期时间有差异，同一系统中不同细胞，其细胞周期时间也有很大差异。一般说来，S+G2+M的时间变化小，而G1期的持续时间差异可能很大。有的细胞如胚胎细胞可能缺乏G1期，V79-8系细胞为G1和G2期的缺乏细胞系。二、细胞周期时相及其主要事件1．细胞周期检验点(cellcyclecheckpoint)细胞周期的有序运转是cdc（celldivisioncycle)基因有序表达的结果，cdc基因的有序表达是受周期中一些检验点或称为调控点调节的。通过上述各个检验点保证了产生具有正常遗传性能和生理功能的子代细胞，如果这些调控途径异常，导致遗传性能紊乱、增殖分化异常和细胞癌变，甚至导致死亡。Cellcycle2.G1期关键事件合成细胞生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂质等，但不合成DNA。限制点(restrictionpoint，R点)，或检验点(checkpoint)是G1期晚期的一个基本事件：影响这一事件的外在因素主要包括营养供给和相关的激素刺激等；而内在因素则主要是一些与cdc基因调控过程相关因素。肿瘤抑制基因p53等监控细胞DNA完整性，在G1期检验点中起负调控作用。染色体处于复制前感受状态或允许(licensing)状态。3．S期关键事件

(1)S期的启动-S期促进因子(S-phasepromotingfactor，SPF)（2）真核生物染色体的复制①真核生物DNA复制的特点多个复制起点成簇活化，向两个方向以复制叉方式进行延长；S期DNA复制的不同步特性：

大多数有转录活性的常染色质复制较早，异染色质复制晚。早S期复制的DNAGC含量较高，晚S期复制的DNAAT含量较高。呈周期性重现；大多数与DNA合成有关的酶系在G1／S交界或早S期升高。②组蛋白的合成与核小体的组装组蛋白的合成主要在S期，在S期组蛋白mRNA的水平可增加50倍。与DNA合成之间存在联动反馈机制，保证组蛋白形成的数量能相应于新合成的DNA数量。核小体组装与“半核小体”复制模型组蛋白合成后被修饰，可进行磷酸化、乙酰化、甲基化和ADP-核糖基化作用，其中组蛋白的磷酸化和乙酰化被认为在调节细胞周期前进中和基因表达方面起重要作用。4．G2期关键事件主要与细胞进入M期所需的多种结构与功能的准备有关：M期染色体凝集的相关事件，如由于H1组蛋白磷酸化的缺陷，阻止了染色体的凝集，导致停止在G2期。有丝分裂纺锤体的形成与发挥作用的相关事件。核糖体的存在与数目对于完成G2期和进入有丝分裂的进程也是起重要作用的。细胞周期调控分子活化，通过G2／M期检验点(G2／Mcheckpoint)，使细胞进入M期。三、测定细胞周期及各时相时间的方法（1）脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法----标记有丝分裂百分数法（PLM）：标记有丝分裂百分率法对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TDR。50100TG20TMTsTcTG2+1/2TMTPLM常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM（2）流式细胞分选仪测定法OneoftheearliestapplicationsofflowcytometrywastheanalysisofcellcyclepositionbyquantitationofcellularDNA.Flowcytometryisstillthemethodofchoiceforfast,accuratedeterminationofcellcycledistributions.LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)UnivariateCellCycleMethodsInthesimplestmethod,cellularDNAisdetectedusingafluorescentdyethatbindspreferentiallytoDNA.Propidiumiodide

ismostcommonlyused.ItundergoesadramaticincreaseinfluorescenceuponbindingDNA.Itrequirespermeabilizationoftheplasmamembrane.Hoechst33342

canbeusedwherelabelingofunpermeabilized(live)cellsisdesired.G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCyclePurdueUniversityCytometryLaboratories02004006008001000PIFluorescenceDNAAnalysis2N4NPurdueUniversityCytometryLaboratories488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector四、细胞周期同步化（一）细胞同步化的概念

细胞同步化是指在自然过程中发生的，或经人为处理造成的细胞周期同步化。前者称为自然同步化，后者称为人工同步化。1.自然同步化

在自然界中，细胞自然同步化的现象在动、植物及粘菌中都有所发现，它们不受人为条件的干扰，因而有可能在接近自然的条件下进行观察。

例子：①多核体

粘菌(Physarumpolycephalum)的变形体(plasmodia)只进行核分裂而不同时伴有细胞质的分裂，因而形成多核体；数量众多的核处于同一细胞质环境中进行同步化分裂，核可多达107，细胞大小可达5-6cm。如果将其切成许多小块，每一小块中的核进行同步分裂，而不同小块之间并非同步，若将不同小块融合在一起则又进行同步化分裂。②某些水生动物受精卵的同步分裂③增殖抑制解除后细胞的同步分裂

2.人工同步化的原理及分类

人工同步化大致可分为选择同步化，诱导同步化或两者的结合。（1）人工选择同步化①有丝分裂选择法（反复振摇法）：Prescott(1956)利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性降低的特点。

此法的特点是细胞不受药物等的伤害，同步化程度高，放入37℃环境中收集的细胞即可同步分裂。

缺点是分裂细胞一般占1%-2％，对于一些生化分析仍感细胞数不够。

②密度梯度离心法：

在某一离心力场中的沉降速度与其半径平方成正比：周期时相不同而细胞大小不同。

将高密度单个细胞悬液置于事先制备好的蔗糖密度梯度上，然后离心沉降或重力自然沉降。分层收集即可获得不同周期阶段的细胞。此法的优点是可适用于任何系统包括悬浮生长的细胞。缺点是同步程度有限，因同一时相的细胞大小并非都一致。

（2）人工诱导同步化①DNA合成阻断法：选用DNA合成抑制剂可逆地抑制DNA合成而不影响其他期细胞沿周期运转，最终可将细胞群体阻断在S期。

5-氟脱氧尿嘧啶，羟基脲，阿糖胞苷，氨甲喋吟，5-氨基尿嘧啶，高浓度AdR，GdR和TdR，均可抑制DNA合成而使细胞同步化。其中高浓度TdR对S期细胞的毒性较小，阻断效果较好，因此成为较常使用的S期阻断剂。

TdR双阻断法:是最常使用的方法向对数增殖期的培养细胞的培液中加入TdR，使细胞阻于S期和G1-S期交界处。当移去TdR，洗涤细胞。当释放时间大于ts时，所有细胞均脱离S期，这时再给予第二次TdR阻断。细胞群体再经过G2+M+G1的时间，则细胞阻断于G1-S交界处的一个狭窄的区段中（tG1+tG2+tm＞ts）。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化。缺点是诱导过程造成细胞非均衡生长(蛋白质、RNA合成并不停止)，细胞体积增大，较正常细胞在周期上有差异，有时出现有丝分裂和染色体的异常。②分裂中期阻断法：某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断于有丝分裂中期。非平衡生长问题不十分明显。但长时阻断释放后许多细胞不能完成正常的有丝分裂而进行异常分裂。中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍生物秋水仙酰胺。

（3）条件依赖性突变株五、特异的细胞周期1．早期胚胎细胞的细胞周期早期胚胎细胞的细胞周期主要指受精卵在卵裂过程中的细胞周期。显著的特点：当受精以后，受精卵便开始迅速卵裂，卵裂球数量增加，但其总体积并不增加，因而，单个卵裂球的体积将越分越小；每次卵裂所持续的时间，即一个细胞周期所持续的时间，大大短于一个体细胞周期所持续的时间；细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准的细胞周期基本是一致的。2．酵母细胞的细胞周期酵母细胞周期的特点：

酵母细胞周期运转过程也包括G1期、S期、G2期和M期等4个时期。参与调控细胞周期的基因与高等生物也基本相同。特点如下：酵母细胞周期持续时间较短，大约为90min。细胞分裂过程属于封闭式，即在细胞分裂时，细胞核核膜不解聚。与细胞核分裂直接相关的纺锤体不是在细胞质中，而是位于细胞核内。芽殖酵母通过出芽进行分裂（而不是对等分裂）。芽殖酵母的纺锤体组装几乎与S期DNA复制同步。在一定环境因素作用下，也进行有性繁殖。植物细胞的细胞周期也含有G1期、S期、G2期和M期4个时期。特殊之处：植物细胞无中心粒和星体，由许多微极组织纺锤体；有丝分裂后期的纺锤体中央区域出现成膜体(phragmoplast)：3、植物细胞的细胞周期4、细菌的细胞周期细菌细胞周期也基本具备4个时期；在快速生长时，细菌每分裂一次仅需要35min，而理论上却需要70min（10min复制起始准备+40minDNA复制+20min染色体分离和细胞分裂）。第二节细胞分裂12.2.1有丝分裂(mitosis)细胞分裂是个体生长和生命延续的基本保证。细胞分裂包括核分裂和胞质分裂（cytokinesis)两个过程。细胞分裂经过长期的生物进化过程由简单而逐渐臻于完善，出现了无丝分裂(amitosis)、有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。随着真核细胞的演化，有丝分裂的机构也随着复杂化，高等真核生物某些种类的器官和组织，在自然状态下有丝分裂存在某些变异。一、有丝分裂的特征是有丝分裂器的产生星体：围绕中心体外辐射状发射的微管。纺锤体：由大量微管在赤道面垂直排列组成的中部宽阔，两极缩小的细胞器，形如纺锤，因而得名。组成纺锤体的微管可以分为两种类型，即动粒微管和极性微管。二、有丝分裂中两个重要的细胞器：

中心粒(centroile)和动粒(kinetochore)

1.中心粒是一对互相成直角的圆筒状小体，直径0.25μm，长度不定，邻近核膜胞质中。筒壁为9组大约呈30度倾斜排列的三联微管组成。中心粒本身对组织微管是不起作用的，例如植物中心体全然缺少中心粒，小鼠早期的卵裂丢失中心粒。中心粒周围是一团透明的电子密度高、不定形的物质，称为中心粒周围物质(pericentriolarmaterial，PCM)或中心体基质。含有一套特异性蛋白质的PCM具有微管组织中心(microtubuleorganizingcenter，MTOC)的作用，是中心体最关键的部分。间期时，以中心体基质为核心向胞质发出微管射线，伸向细胞边缘，PCM处为负端，周缘端为正端。

AtacertainpointinG1phasethetwocentriolesseparatebyafewmicrometers.DuringSphaseadaughtercentriolebeginstogrownearthebaseofeacholdcentrioleandatarightangletoit.TheelongationofthedaughtercentrioleiscompletedbyG2phase.ThetwocentriolepairsremainclosetogetherinasinglecentrosomalcomplexuntilthebeginningofMphase,whenthecentrosomesplitsintwoandthetwohalvesbegintoseparate.

2.动粒和着丝粒动粒又称着丝点是细胞分裂的重要细胞器，是有丝分裂时纺锤体微管附着于染色体的部位。后期时动粒微管变短，将两条染色单体拉向两极，遗传物质平均地分配到两个子细胞中去。动粒结构中主要是蛋白质(发现有微管蛋白、CaM、动力蛋白以及糖酵解的烯醇酶等)其中有少量的RNA和DNA的存在。动粒蛋白CENP(CentromereProtein)CENP在进化上有高度保守性，但分子量，随动物种类、不同发育阶段、不同细胞周期有所差异：CENP-A是着丝粒区域的一种特殊组蛋白，与组蛋白H3有一些进化上的关系；推测它可能直接参与着丝粒-动粒复合体的染色质的包装及功能。CENP-B是DNA结合蛋白，并和微管蛋白相联系。CENP-C主要位于动粒的三层结构的内层，只存在于活性着丝粒染色体上，有CDC2激酶磷酸化位点和微管结合蛋白(MAP)激酶作用位点。CENP-E是一种驱动蛋白(kinesin)，定位于动粒外层表面的冠上。被认为在促使染色体与来自两极的微管相联结过程中起重要作用。CENP—F是一种核骨架蛋白，在分裂前期，转移到动粒上。三、有丝分裂过程有丝分裂是一个核改组的连续过程，根据形态学特征，人为地分为前期、早中期、中期、后期及末期。1.前期(prophase)

标志：染色质不断浓集包装，中心粒出现远离。事件：有丝分裂器的形成，纺锤体出现线状纤维;核仁消失，核膜崩解。特征：每条染色体形成2条染色单体的成双结构，出现主缢痕。Newmicrotubulesgrowoutinrandomdirectionsfromtwonearbycentrosomes.Themicrotubulesareanchoredtothecentrosomebytheirminusends.Theirplusendsare"dynamicallyunstable"andswitchsuddenlyfromuniformgrowth(outward-pointingredarrows)torapidshrinkage(inward-pointingredarrows),duringwhichtheentiremicrotubuleoftendepolymerizes.Whentwomicrotubulesfromoppositecentrosomesinteractinanoverlapzone,microtubule-associatedproteinsarethoughttocross-linkthemicrotubulestogether(blackbeads)inawaythatcapstheirplusends,stabilizingthembydecreasingtheirprobabilityofdepolymerizing.Thereisevidencethatthecross-linkingproteinsareplus-end-directedmicrotubulemotormoleculesthattendtodrivethemicrotubulesinthedirectionsthatpushthepolesofthespindleapart.

2.早中期(prometaphase)

标志：核膜崩解。事件：纺锤体微管自由端最终结合到动粒上，形成染色体牵丝。特征：染色体剧烈地活动。Thekinetochorebindstothesideofagrowingmicrotubuleandslidesalongittowardthespindlepole.

Twohypothesesforhowchromosomeslineupatthemetaphaseplate.

Inbothcasesthechromosomesenterthespindlerandomlyduringprometaphase.In(A)thechromosomeseventuallylineupattheequator(themetaphaseplate)becauseapullingforceoneachkinetochoreincreasesasitgetsfartherfromapole.In(B)thechromosomesendupattheequatorbecausetheastralexclusionforces

pushthemthere.Inbothcasesthechromosomesareheldundertensionattheequatorbybalancedforces.

Whilethekinetochoremicrotubulestendtopullthechromosomespoleward,another,moremysteriousforceactsinanoppositedirection,repellinganylargeobjectthatapproachesthepolestooclosely.Theoriginofthis"astralexclusionforce,"or"polarwind,"isnotknown.Itmaybetheresultofpushingbythegrowingendsofthefreemicrotubulesthatarenucleatedcontinuallyatthepole;alternatively,thefreedchromosomearmsmaybindplus-end-directedmicrotubulemotorsandmigratealongsuchmicrotubules;orsomeothercellcomponentsmaybemovinginthatwayandsweepingthechromosomearmsalongwiththem.3.中期(metaphase)

标志：染色体排列在赤道面上。事件：连续微管和动粒微管持续延长，纺锤体不断远离。特征：染色体牵丝作用于染色体上的力量持平。Experimentdemonstratingthatmetaphasekinetochoremoleculesaddsubunitsattheirkinetochore-attached(plus)end.

Inthisexperimentfluoroscein-labeledtubulinwasinjectedintoalivingcell,whereitbecameincorporatedintothespindlemicrotubules(green).Rhodamine-labeledtubulinwasthenintroducedintothecellatmetaphase,whereitbecameincorporatedintokinetochoremicrotubulesatthekinetochore-attached(plus)end(orange).Someincorporationisalsoseenatthecentrosome.微管的延长是微管蛋白α、β二聚体的组装大于去组装的结果，由G2期末到中期，星体和纺锤体微管均靠（+）端的延长推动中心粒分向两极。组成纺锤体的微管数目不等，酵母细胞可少到16条，高等植物可达5000条.Microtubulesinamitoticcell.

Duringprophase,fibroblastswereextractedbyaseriesofsolutionsofdetergentsandconcentratedsaltssothatonlythemicrotubulesremain.Theindividualmicrotubluesareseenradiatingfromthecentriolarregion.womanchromosome

4.后期(anaphase)

标志：姐妹染色单体突然同时分裂。事件：动粒受到不断缩短的染色体牵丝的牵引而产生染色体的向极移动。特征：动粒在前，两臂拖后，视动粒在染色体上的位置不同，而呈V、L或J型。Mad和Bub可以使动粒敏化，促使微管与动粒接触。免疫荧光染色发现，Mad2和Bub1位于前期和前中期染色体的动粒上。如果染色体被纺锤体微管捕获，Mad2和Bub1很快会从动粒上消失。染色体不能被微管及时捕捉，Mad2和Bub1不能从这些染色体的动粒上消失，后期则不能启动，染色单体不能相互分离。Mad2可以与后期促进因子复合体(APC)及其他相关物质结合，抑制APC的活性，阻止细胞周期向下一个阶段发展。以微束激光打击中期染色体的动粒之一时，这一对染色体单体立即移向另一动粒面向的一极，动粒微管缩短，类似后期发生的事件。染色体的向极运动称为后期A。两极间的距离增加称为后期B。这两者是完全独立的运动类型，例如用低浓度的水合氯醛处理，可以阻止极间牵丝的延长和极向两极移动，而完全不影响染色体牵丝的作用。Thebehaviorofkinetochoremicrotubulesatmetaphaseandanaphase

（A）在动粒中ATP分子水解可以提供能量驱动微管上的“行走蛋白”(walkingprotein)，即类动力蛋白马达分子向极部移动，拉动染色体向极移动。（B）随着动粒端的微管去组装，动粒倾向于向极滑行以恢复“袖筒”壁与微管的结合而拉着染色体向极部运动。ModelofHowMicrotubuleMotorProteinsAreThoughttoActinAnaphaseB.

In(A)plus-end-directedmotorproteinsofthekinesinfamilycross-linkadjacent,overlapping,anti-parallelpolarmicrotubulesandslidethemicrotubulespasteachother,therebypushingthespindlepolesapart.Theblackarrowsindicatethedirectionofmicrotubulesliding.In(B)minus-end-directedmotorproteinsbindtothecellcortexandtothoseastralmicrotubulesthatpointawayfromthespindleandpullthespindlepolesapart.移动素类蛋白(knesin—relatedproteins，KRPs)和细胞质动力蛋白(dynein)的作用KRPs为向微管负极运动的蛋白，而细胞质动力蛋白为向微管正极运动的蛋白。中心体分离时，负向运动的动力蛋白在来自姐妹中心体的微管之间搭桥，并向负极运动；正向运动的动力蛋白在纺锤体微管之间搭桥，借助向微管正极运动，将纺锤体拉长，中心体之间的距离逐渐加大。当纺锤体拉长到一定程度后，负向运动的动力蛋白在细胞膜和星体微管之间搭桥，借助负向运动，将星体拉近两极的细胞膜，纺锤体也进一步被拉长。有丝分裂过程中纺锤体的动态变化及其与染色体运动的关系？早期：纺锤体的形成（动态变化，负向动力蛋白）；早中期：染色体的捕捉和赤道面排列（拉推平衡）；中期：连续微管和动粒微管持续延长，纺锤体不断远离（正端>负端，正向动力蛋白）；后期：纺锤体不断远离连续微管延长（正端>负端，正向动力蛋白）；星体微管缩短（正端>负端，负向动力蛋白）；染色体分离，移向两极；动粒微管缩短（正端>负端，负向动力蛋白）；5.末期(telophase)

标志：染色体平均地分到纺锤体的两极。事件：形成核膜，RNA合成恢复，核仁重新出现。特征：染色质去螺旋化，高度分散在间期核中。Atypicaltimecourseformitosisandcytokinesis(Mphase)inamammaliancell.

Thetimesvaryfordifferentcelltypesandaremuchshorterinembryoniccellcycles.Notethatcytokinesisbeginsbeforemitosisends.Thebeginningofprophase(andthereforeofMphaseasawhole)isdefinedasthepointinthecellcycleatwhichcondensedchromosomesfirstbecomevisible-asomewhatarbitrarycriterion,sincetheextentofchromosomecondensationappearstoincreasecontinuouslyduringlateG2.6.胞质分裂(cytokinesis)

在动物细胞方面，虽然核分裂和胞质分裂是相继发生的，但是属于两个分离过程。在细胞中部微管反而增加，其中掺杂有浓密物质和囊状物，这一结构称为中体。后期细胞质膜下贮存有大量的泡状质膜备用。由中、晚后期开始，在细胞中部赤道面处胞质向下起沟，形