显微摄影技术汇总

实验报告的书写要求实验原理/要求/目的实验器材及准备实验方案及操作步骤实验数据记录和计算实验结果及分析个人用品：帽子，手套，口罩，拖鞋。显微摄像技术廖继东电话：02085225841E-MAIL:tliaojd@什么是显微摄像？

显微摄像即利用摄像装置（传统相机、数码相机、专用CCD记录系统）拍摄显微镜视野中所观察到的物像。被拍摄物体的影像质量，取决于显微镜光学性能、摄像记录系统配制和操作水平。内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄像有关的基本光学概念显微摄像系统的基本构成显微摄像基本操作程序影响显微成像质量的因素光学显微镜的种类及结构特征按照其光路结构、分辨模式可分为正置显微镜、倒置显微镜、体视镜、偏光镜等；按照其照明光源性质可分为可见光（明视场、弱视场）、荧光（紫外、红外）显微镜；按机械部件的控制方式分为手动、电动和全自动显微镜。光学显微镜的种类及结构特征明视场显微镜即我们通常所说的显微镜，照明光源采用普通灯泡或卤素灯，包括正置显微镜、倒置显微镜、体视镜，主要用于常规组织标本染色，如HE染色和免疫组织化学染色样本的观察。弱视场包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光显微镜，照明光源与明视场显微镜通用，只是在光路上插入不同的部件降低背景光的强度，曾强被观察样本的反差，提高对透明样本的观察能力，主要用于活组织未染色样本的观察。光学显微镜的种类及结构特征荧光显微镜，照明光源采用汞灯或高能氙灯，通过不同的率光片组合获得不同的激发/发射光，主要用于荧光染色标本的观察。目前由于冷光源技术的开发及荧光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获得了广泛的应用。

内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄像有关的基本光学概念显微摄像系统的基本构成显微摄像基本操作程序影响显微成像质量的因素光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数透镜及其性能透镜（lens):透镜是由透明物质（如玻璃等）制成的一种光学元件。透镜是折射镜，其折射面是两个球面，或一个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚像。透镜一般可以分为两大类：凸透镜和凹透镜。中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜，有双凸、平凸、凹凸三种；中央部分比边缘部分薄的叫凹透镜，有双凹、平凹、凸凹三种。凸透镜具有会聚光线的作用，所以也叫会聚透镜。凹透镜具有发散光线的作用，所以也叫发散透镜。透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个或多个透镜组成。虚像/实像：光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。焦点与焦平面：

当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点”；通过交点并垂直光轴的平面，称“焦平面”。焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点”，该处的焦平面，称“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点”，该处的焦平面，称“像方焦平面”。光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数显微镜的成像原理a.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；b.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像；c.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像；d.当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；e.当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像。

显微镜的成像原理就是利用上述（c）和（e）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F（F为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距F1之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）、人眼的明视距离（250mm）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像于原物体的像，方向相反。

光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数影响成像的关键因素—相差

色差（Chromatic

aberration）：

色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红

橙

黄

绿

青

蓝

紫

七种组成，各种光的波长不同

，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。

球差(Spherical

aberration)：

球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮

边缘逐渐模糊的亮斑。从而影响成像质量。

球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。慧差(Coma)：

慧差属轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点壮，型如慧星，故称“慧差”。像散（Astigmatism）：

像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。场曲（Curvature

of

field）：

场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个相面，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。畸变（Distortion）：

前面所说各种相差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真。光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数主要光学部件及性能物镜（objective）:物镜是显微镜最主要的光学部件，显微镜的分辩力主要取决于物镜的数值孔径（镜口率，numericalaperture,NA）。目前常见物镜：消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜。数值孔径(NA)数值孔径（numericalaperture,NA），是物镜和聚光镜的重要技术参数，是判断光学元件性能的重要标志。它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(η(Eta))和孔径角(u(upsilon))半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=ηsinu/2。消色差物镜（achromaticobjective,Ach）。这是一种常见的物镜，物镜外壳上不列代表标志。物镜把光谱中红蓝光聚焦于一点，黄绿光聚焦于一点，最清晰范围为510～630纳米。这种物镜一般不适宜作摄像用，如加黄绿滤光镜，可获得较为清晰的照片。复消色差物镜（apochromaticobjective,Apo）。这种物镜能把光镜中红、蓝、黄光聚焦于一点，纠正了红蓝光的色差和黄绿光的球差，最佳清晰范围为400～720纳米。这种物镜适用于在任何色光下或加用各色滤色镜进行观察摄像，适用于彩色摄像。但Apo物镜残留有像场弯曲，使平面物体形成类似球面的弯曲影像，结果使视野中心和边缘的影像不能同时聚焦，拍出的底片中心清晰，边缘模糊或者相反。半复消色差物镜（荧光石镜，fluoriteobjective,Fl）。最佳清晰范围430～680纳米，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间。平场消色差物镜(planachromaticobjective,lp)。这种物镜纠正了以上三种物镜的缺陷，校正了像场弯曲，不存在视野中心与边缘不能同时准焦的现像。由于影像展开，在同样倍数下，影像要比一般物镜的影像大。平场消色差物镜有多种类型，外壳上刻有plan.Apo。平场复消色差物镜是最佳物镜。物镜标识物镜色差程度：Apo(复消色差物镜)Fl(荧石物镜)plan或pl(平场消色差物镜)。放大倍数/数字孔径：2.5，4（5），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。标准机械筒长：160mm或170mm。盖玻片厚：0.17mm，常以170mm/0.17mm表示，载玻片厚小于1.2mm。物镜与被检样品的介质：干燥系物镜无标志；油浸镜标有OIL、OEL、HL或IMM字样；水浸镜标为W；甘油为Glyz。目镜(eyepiece)目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。物镜由两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的中间像就落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目镜外相交，这个相交点称为眼点（eyepoint）。观察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像晃动和不适的感觉，影响观察效果。目镜(eyepiece)由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或CCD）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一般在2.5～6.7倍之间。照相目镜外侧或端面刻有“PHOTO”、“FK”、“NFK”字样。目镜与物镜的组合物镜放大倍数1040100物镜数值孔径0.250.651.25有效放大倍数125～250325～650625～1250目镜放大倍数12.5～258～166～12.5

显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径的500～1000倍。目镜与物镜组合前提是使放大倍数在有效放大率范围内。在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数时，所得放大倍数叫“空的放大”，影像细节的分辩能力没有提高。在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合例如数值孔径为1.3的物镜（标记为100/1.3）与放大倍数为4的目镜组合，总放大倍数为400，若入射光为绿色光（550纳米），分辩力为270纳米。数值孔径为0.65的物镜（标记为40/0.65）与放大倍数为10的目镜组合，总放大倍数为400，λ＝550纳米时分辩力为500纳米。两种组合结果，显然第一种能提高物像分辩力。不同照像目镜/物镜组合的效果聚光器(condenser)聚光器的主要作用是使光线集中于标本，配合物镜提高物像的分辩力。聚光镜：聚光镜由一至数片透镜组成。聚光镜有聚光作用，它的数值孔径在0.25～1.40不等，聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制。孔径光阑：孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小，使图像分辩力、反差和焦深处在最佳状态。显微镜的功能主要取决于物镜的性能，而物镜的性能又取决于物镜的数值孔径，物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。但显微摄像不同于一般摄像，其最大的区别是影像反差小、焦深浅，这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物镜的分辩力的亮度降低，但影像反差和焦点深度提高，使影像更加清晰。所以，在不过多降低分辩力前提下，要将孔径光阑数值调到所用物镜数值孔径的60％～80％。

物镜有效数值孔径＝(物镜NA+聚光镜NA)/2注意若显微摄像的照明光线过强，可以改变灯的亮度（降低电压），用深色率光片或增加率光片的数目。千万不要改变聚光器的位置或缩小光圈，否则会降低显微镜的分辩力。若被检物为活体标本或未染色标本时，应缩小孔径光阑，加强明暗对比。但为了防止物镜的分辩力的降低，必须加强照明光线的强度，但孔径光阑数值一般不能小于物镜孔径光阑数值的60％。若聚光器外方没有刻度时，可以在标本调焦后，取下目镜，眼睛离目镜头5～10厘米，左眼观察镜筒，边看物镜的后焦点平面，边缓慢增大孔径光阑，至物镜后透镜呈一明亮园时再将孔径光阑适当缩小（估计其为物镜孔径数值的2/3），然后放回目镜。视场光阑视场光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径，它根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积。视场光阑过小，视野亮度不足，影像不清晰；视场光阑过大，光束直径超出孔径光阑，造成光线的乱反射，也影响影像的清晰度。一般观察时，应先用聚光器上的调中螺旋把视场光阑调到视场中心位置，然后让视场光阑多边形光阑处于视场的外切位。显微摄像时，视场光阑收缩至取景框边缘的外方（但不能接触取景框），此位可使图像反差得到改善。如果视场光阑收缩得过于接近取景框时，则图像的四角将被切去。因为实际拍摄的视场范围要比取景框略大一些。视场光阑的配合使用根据不同倍率物镜给予不同直径的光束；避免散射光，增加图像反差；适度：视场光阑像恰在取景框的外缘。过于接近或超过则会将图像的四角切掉。视场光阑配合使用光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数分辨率：显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称"鉴别率"。其计算公式是σ=λ/NA式中σ(sigma)为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。放大率和有效放大：率经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积,显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。焦深：焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。视场直径：所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。覆盖差：由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差.国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。工作距离(WD)：工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄像有关的基本光学概念

显微摄像系统的基本构成显微摄像基本操作程序影响显微成像质量的因素折射和折射率折射：

光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播。当光从一种介质斜射入另一种介质时，传播方向发生变化，这种现像叫光的折射，这是由于光线在不同介质的传播速度不同造成的。折射光线与发线之间的夹角称折射角，同理入射光线与法线之间的夹角称入射角。光的折射规律：光从空气斜射入水或其他介质中时，折射光线与入射光线、法线在同一平面上，折射光线和入射光线分居法线两侧；折射角小于入射角；入射角增大时，折射角也随着增大；当光线垂直射向介质表面时，传播方向不变，在折射中光路可逆。折射和折射率折射率：是表示同一光线在两种（各向同性）介质中光速比值的物理量。绝对折射率光从真空射入介质发生折射时，入射角i与折射角r的正弦之比n叫做介质的“绝对折射率”，简称“折射率”。它表示光在介质中传播时，介质对光的一种特征。相对折射率光从介质1射入介质2发生折射时，入射角θ1与折射角θ2的正弦之比n21叫做介质2相对介质1的折射率，即“相对折射率”。因此，“绝对折射率”可以看作介质相对真空的折射率。色温与白平衡黑体（blackbody）：黑体是一种可将落在其上的所有热量吸收，而无损的转化成为“光”向外辐射的理想物质，辐射光的颜色成分与该黑体所受热量值（温度）相对应。色温（colourtemperature）：色温是表示光颜色视觉印像的物理量，是量度和计算光线颜色成分的尺度。光源发射的光的颜色与黑体在某一温度下辐射光色相同的光时，黑体的温度即为该光源的色温。色温用开氏温标表示（Kelvintemperaturescale.K）,K=℃+273.15。光源色温不同，光色亦不同。色温与白平衡白平衡（WhiteBalance）：物体颜色会因投射光线颜色产生改变，在不同光线条件下拍摄出的图像会有不同的色温。白平衡就是在特定光线条件下，按视野中图像特质，找出白色区域，默认为“白色”，并调整整个图像红绿蓝三色的强度，以修正照射光线所造成的误差，进而解决色彩还原和色调处理等一系列问题，使图像的色调恢复到原色状态。开氏温标示意图越低的数值表示越“红”，越高的数值表示越“蓝”。红和蓝并不是光线本身颜色，只是表明光谱中的红或蓝成分较多。不同光源环境的色温表内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄像有关的基本光学概念显微摄像系统的基本构成显微摄像基本操作程序影响显微成像质量的因素传统光学显微摄像系统数码显微图像分析系统系统配置：◆万能研究级显微镜◆专用摄像头◆定制高清晰度专用图像采集卡◆进口原装摄像头专用标准C接口◆高性能商用计算机◆专用图像分析软件

显微图像分析系统显微荧光图像分析系统成像质量要求BF：追求分辨率、色彩还原FL:追求敏感度定量分析：图像可比性环境要求•无尘、无振动；•避免强光照射-影响对焦准确性；•房间照度不能过强，散射光、照明的眩光透过物镜、聚光镜等会反射到光路中，干扰正常成像；•无腐蚀性气、物；•防潮、防霉。软件基本功能要求◆可充分利用WINDOWS系统资源，全面支持多种操作系统；◆可与显微镜联动或控制显微镜的相关功能；◆具有程序设计手段，可进行分析过程的全自动设置；◆悔步、重复功能，方便寻找最佳处理路径；◆在线帮助；图像输入：支持视窗平台，支持模拟CCD、数字CCD、数字冷CCD、数码相机、扫描仪等图像摄入设备；支持多种图像采集卡；支持JPEG、TIFF、BMP、GIF、PCX、DIB、EPS、WMF、TGA、WPG和部分非标准图像格式；支持24/48位真彩色图像采集；符合GB15445、美国ASTM112及ISO9276标准。特征范围选取：具有多种图像特征的选取工具（矩形框、圆形框和自画任意框等），不限制多层彩色分割，图像数学运算。专业图像处理与分析功能：包括色度调整，图像变形，数字形态学处理，图像增强，图像匹配，纹理分析，特征识别等。具有颗粒自动识别、粘连颗粒自动切分功能，以利复杂图像的准确分析。图像参数测量图像定量分析提供点、线、面积和角度测量四大类；提供多种的测量参数，如面积、周长、长轴、短轴、形态因子、异型指数、圆形度、平均灰度、平均光密度、积分光密度、绝对光密度、光密方差度、核浆比等。分析数据的可视化处理使分析结果与图像之间构成直接映射关系，便于观察分析。数值统计：自动对目标图像进行分割、计算、统计、归类等操作，并可自动编号，逐个显示被跟踪目标的全部参数；用户可自行设置测量参数或编辑用户所需测量参数，并可进行分类。白平衡：软件支持将不同时间、不同亮度、不同拍摄曝光设置下图片进行背景修正，以更科学的计算光密度相关的参数。

免疫组化分析：支持对免疫组化图片进行面积含量、数目含量以及和光密度有关的各类参数。

图像定标和校正：可定标图像到任何测量单位，并以实际尺寸参数对目标进行分析计算或打