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文档简介

实验九、DNA的PCR扩增及其检测一、实验目的了解聚合酶链式反应(PCR)的原理掌握PCR实验的方法PCR结果的检测二、实验原理(一)PCR的原理

PCR是以单链DNA为模板，四种dNTP为底物，利用寡核苷酸引物与模板3’端的特异性结合，在DNA聚合酶的催化下合成模板的互补链

PCR反应通常包括25-30个循环，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。假定扩增效率为1，经过30个循环后，目标DNA分子数将提高到起始时的1073741824倍（即230倍）时间(min)557294温度(℃)第n个循环变性退火延伸延伸变性Y=X(1+E)NY:扩增后目标DNA分子数；X:起始时目标DNA分子数；E:扩增效率(0≤E≤1)；N:扩增循环数（在理想条件下）PCR的技术关键引物设计、引物保存、防止污染、反应条件优化、……PCR的衍生技术反转录PCR、反向PCR、巢式PCR、原位PCR、多重PCR、多重等位基因PCR、不对称PCR、锚定PCR、荧光定量PCR、……PCR的应用基因克隆、DNA测序、定点突变、基因分型、疾病诊断、亲子鉴定、嫌犯验证、转基因检测、基因表达水平分析、……PCR产物电泳(照片）酶切产物电泳（示意图）(三)PCR产物检测的方法三、实验材料和试剂(一)PCR扩增

1.模板：番茄(Solanumlycopersicum)基因组DNA

2.引物：

3番茄PCR反应体系（10μL）成分含量F-primer0.1μMR-primer0.1μMDNA模板20ngdNTPs0.2mMMgCl25mMTaq聚合酶0.5U10×Buffer1μLddH2O补充至10μL(一)PCR扩增试剂盒：

ddwater

2μl

PremixTaq

5μl模板DNA1μl引物2μl

总体积10μl←番茄DNA←正、反引物已预混注意：(1)冰上操作(2)混匀(3)在管上做好标记（统一编号）PCR边缘效应：PCR仪边缘各孔的扩增效果稍差111213121222323132333414243451525356162636717273781828389192939102030402.PCR反应条件

（由教师设置）94℃4分钟94℃45秒55℃45秒72℃60秒72℃7分钟4℃30分钟循环35次预变性变性退火(模板～引物)延伸(0.8-1min/kb)延伸降温(暂时保存)Ty-1酶切反应体系（10μL）2023/2/7成分含量TaqⅠ(Taq酶)0.5μL0.1%BSA1μL10×Buffer1μLPCR产物7.5μL65℃酶切时间为2小时琼脂糖凝胶电泳制胶：称取1.2g琼脂糖，溶于100mL1×TAE溶液中（微波加热至完全融化）；加入10μL的核酸染料；将混合均匀的液态胶倒入胶板，插好梳子待其凝固（约40分钟）上样：一般第一个点样孔加入5μL的2000bp的Marker，往其它点样孔中滴入5μL的PCR产物或酶切产物电泳：调节电泳仪电压为180V，电泳30-40min保存：利用凝胶成相系统对胶板进行拍照并保存。

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